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RNAi沉默EGFR基因对卵巢癌放疗敏感性的影响 作者：林远洪 吴永忠 李少林 郭启帅 罗茜  【摘要】 目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因对卵巢癌放疗敏感性的增强作用。方法 构建针对EGFR基因序列特异性短发夹状RNA(shRNA)表达载体，应用卵巢癌SKOV3细胞建立裸鼠移植瘤模型，随机分为对照组、单纯放疗组、基因放疗组，采用MV X线照射裸鼠瘤组织，监测瘤体积，测量瘤质量，取瘤组织行RTPCR、Western印迹、免疫组化、电镜检测。结果 治疗 后三组瘤体积差异均显著(均P 【关键词】 EGFR基因;RNA干扰;放疗;卵巢癌  【Abstract】 Objective To explore the effects of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene on the radiosensitivity of ovarian cancer by RNAi technology. Methods EGFR gene sequencespecific shRNA expression vector were constructed. Tumoranimal model with ovarian cancer SKOVcells were established and the nude mice were randomly divided into control, radiotherapy and generadiotherapy groups. The ovarian cancer tissue was irradiated by MV Xray. Tumor volume and tumor wEight were measured. RTPCR, Western blot, immunohistochemistry and electron microscopy were used to detected cancer tissue. Results There were obvious difference among three groups in tumor volume (P 【Key words】 EGFR gene;RNA interference;Radiotherapy;Ovarian cancer  表皮生长因子受体(EGFR)的高表达与肿瘤恶性程度、转移、放化疗敏感度下降密切相关，可作为诊断及判断预后的指标，许多阻滞和下调EGFR的方法被用来抑制肿瘤增殖以改善预后，并已显示出初步疗效及良好的安全性，因此EGFR成为目前公认的肿瘤基因治疗的重要靶位〔1〕。本实验选择放疗相对不敏感的卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，以目前分子靶向治疗中的EGFR基因为靶点，采用RNA干扰(RNAi)技术，探讨EGFR基因与卵巢癌放疗敏感性的关系，实验初步显示了RNAi技术在卵巢癌基因放疗中的潜在作用，为肿瘤治疗提供新策略。  　1 材料与方法  主要材料 卵巢癌SKOV3细胞株购自中科院上海细胞生物研究所;BALB/C雌性裸鼠购自北京维通利华公司。脂质体lipofectamineXX购自Invitrogene公司;去内毒素质粒提取试剂购自Omega公司;鼠抗EGFR单克隆抗体购自Santa Cruz公司;蛋白提取试剂盒购自赛百盛公司;免疫组化试剂盒及SDSPAGE凝胶购自博士德公司;总RNA提取试剂购自华舜公司;RTPCR试剂盒购自宝生公司。  1.方法  靶向EGFR基因shRNA表达载体的构建 根据siRNA的设计原则及质粒载体pGenesil的多克隆位点特点，选择EGFR家族同源性基因片段(TGGGGTCGTCAAAGACGTT)为模板，利用美国Dharmacon公司siRNA设计软件，获得靶向EGFR基因序列特异性shRNA的质粒载体(pGenesilEGFR)：正义链：5′UGGGGUCGUCAAAGACGUU3′;反义链：5′ACCCCAGCAGUUU  CUGCAA3′;以此序列为基础,中间加入CUAUGGACA茎环序列将其分隔为反向重复序列，两端加上BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，送武汉晶赛生物工程公司合成。  建立卵巢癌移植瘤模型 采用常规培养细胞种植法，取对数生长期的SKOV3细胞，制成4×107个/ml的细胞悬液，取接种于每只BALB/C裸鼠右肩胛皮下，观察肿瘤生长情况。w后将成瘤裸鼠随机分为对照组、单纯放疗组、基因放疗组，每组6只。  照射裸鼠瘤组织 每组采用瘤内及瘤周多点注射