莱氏野村菌的发酵工艺与田间应用潜力评测-森林保护学专业毕业论文.docxVIP

I I 摘要 莱氏野村菌（Nomuraea rileyi (Farlow) Samson）是一种重要的昆虫病原真菌，国 内外在该菌的生物学、流行病学等研究领域有较多的研究，但在国内至今尚无商品制 剂注册。本研究在前人的研究基础上，对莱氏野村菌菌株的发酵工艺进行了进一步的 研究，包括莱氏野村菌液体培养的形态学观察、固体培养基的优化与发酵工艺研究等； 同时通过众多菌株的室内毒力测定，筛选出对斜纹夜蛾（Spodoptera litura）、甜菜夜 蛾（Spodoptera exgua）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）等 3 种夜蛾科害虫具有高毒 力的菌株，并对高毒力菌株的田间应用技术及效果进行了研究与田间评测。 莱氏野村菌的固体发酵工艺是该菌培养及工业化生产中的瓶颈问题。本研究从莱 氏野村菌培养基配方入手，优化培养基配方，以获得更高的发酵效率。研究中用单因 子筛选法从面粉、大米、黄豆粉、棉子粉 、燕麦粉等几种农产品中筛选出莱氏野村 菌菌株固体发酵的最佳基质。同时，通过在基本培养基质中加入不同的黄粉虫粉、酵 母粉、蛋白胨等氮源，比较孢子得率，从中筛选出能促进莱氏野村菌生长、产孢的最 佳氮源。另外，通过在筛选出的培养基质中加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖 等不同的碳源，比较孢子利率，确定最佳碳源。实验结果显示：在棉籽粉中加入 2% 的酵母粉 和 3% 乳糖 可以作 为莱氏 野村菌 较 适宜固体 发酵培 养基， 产孢量 可达 3.32±0.38×108/cm2。 本文对莱氏野村菌的浅盘固体发酵工艺及薄层发酵工艺进行了研究。浅盘固体发 酵工艺研究中，对基本培养基大米和碎大豆的发酵效率进行了比较。在基本培养基按 25%接种量接种培养 3d 的莱氏野村菌 SMY 培养液，搅拌均匀后，铺浅盘进行固体发 酵，料厚 1cm，然后置于 25±1℃下光照培养，培养 10d，以使其充分产孢。产孢量测 定结果为：以大米为培养基的产孢量为 0.4±0.22×108 孢子/g，而以碎大豆为培养基的 产孢量则达到 6±1.83×108 孢子/g。 在薄层发酵工艺中，以 6%的棉籽粉、2%酵母粉、1.5%琼脂为配方制备培养基， 高温灭菌手喷涂到塑料平板托盘上，待其冷却凝固后，喷雾接种莱氏野村菌孢子悬浮 液。为避免培养基在发酵过程中的水份蒸发，将接种后的托盘用保鲜膜密封后，置于 25±1℃下光照培养。薄层发酵工艺在第 10d 的产孢量可达 2.45±0.16×108 孢子/cm2， 且此时薄层喷涂的培养基中已利用充分，极易干燥及收孢。 高毒力莱氏野村菌菌株的筛选是进行后继应用研究及产品开发的基础。本文在前 期粗筛的基础上，确定了 Nr03、Nr06、Nr09、Nr11 和 Nr15 等 5 株莱氏野村菌为进 一步研究对象。用喷雾法对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫等 3 种夜蛾科害虫进行进一 步的室内毒力测定。在孢子悬浮液浓度分别为 1×105、1×106、1×107 孢子/mL2，喷雾 I II 塔雾化接种时单位面积的孢子附着量为 188.9～4048.3 孢子/mm2。时间-剂量-死亡率 模型分析显示：5 株莱氏野村菌菌株 Nr03、Nr06、Nr09、Nr11、Nr15 在 188.9～4048.3 孢子/mm2 接种量范围时，斜纹夜蛾第 10d 时的死亡率为 60%～95%，其中菌株 Nr15 对斜纹夜蛾的毒力水平最高，第 10d 时的侵染率达到 95%。Nr15 菌株对斜纹夜蛾的 半致死浓度（LC50）为 266.7 孢子/mm2，而在 4048.3 孢子/mm2 浓度下的半致死时间 （LT50）为 5.81d。供试的 5 株莱氏野村菌菌株对棉铃虫与甜菜夜蛾的致病力相对较 弱，侵染率均不足 50%。试验结果表明，莱氏野村菌菌株对夜蛾科害虫体现出明显的 寄主专化性，对高毒力菌株呈献明显的量效关系。本研究中筛选出了高毒力的 Nr15 菌株，可用于斜纹夜蛾生物防治的后继研究。 莱氏野村菌 Nr15 菌株的田间试验设置了 1×108、1×107 孢子/ml 两个处理浓度及 1 个空白对照。用超低量喷雾的方法防治白菜上的斜纹夜蛾。每天观察记录各小区每棵 植株上的僵虫数，直至老熟幼虫开始化蛹为止。处理前后斜纹夜蛾死亡率（%）和较 正死亡率（%）的计算结果显示，在田间处理后第 13d，处理浓度为 1×107 孢子/ml 的处理区，死亡率（%）和较正死亡率（%）分别为 96.56±5.12%和 96.36±5.68%； 而 1×108 孢子/ml 处理区的死亡率（%）和较正死亡率（%）分别为 96.3±2.6%和 96.09 ±3.01%，两种浓度处理间在死亡率的差别上不明显，均取得了非常显著的田间