三氧化二砷对体外培养的人视网膜色素上皮细胞作用的实验分析-眼科学专业论文.docxVIP

郑州大学2005年硕士毕业论文 郑州大学2005年硕士毕业论文 摘要 三氧化二砷对体外培养的人视网膜色素上皮细胞作用的实验研究 研究生 苏亚丽 导师 李秋明 郑州大学第一附属医院 眼科 郑州450052 摘要 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vjtrcorctinopathy，PvR)是指孑0源性视网 膜脱离或视网膜脱离复位手术后，及眼球穿通伤后，由于玻璃体内及视网膜表面 的细胞增生和纤维膜收缩，造成牵引性视网膜脱离。是孔源性视网膜脱离的严重 并发症和手术失败的最主要原因，也是常见的难治性致盲眼病之一。 PVR的确切发病机制尚未能完全了解，但其基本病理过程已经明了，经过大 量的实验和临床研究，认为PVR属于眼内发生的过度损伤修复反应，是多种细胞 相互作用，眼内、眼外多神因素相互影响的多因素疾病。其中视网膜色素上皮(retinat pig珊ent epithelium，RPE)细胞的过度增生是PVR的主要病理改变。RPE细胞几乎 在所有的PVR膜中都可以观察到，它可以转化成不两的形态，具有多种功能，如 分泌各种刺激因子、转化成巨噬细胞、合成胶原等，在生长因子的刺激下发生增 生。 过去的数十年内经玻璃体手术治疗PVR已日趋成熟，成功率显著提高，现代 玻璃体手术可以解除视网膜牵拉使视网膜复位，但通常情况下手术本身并不能阻 止细胞增生和PVR纤维膜的形成，所以术后仍有一定复发搴。为了提高视网膜手 术在治疗PVR中的成功率，近年来很多研究都尝试用药物辅助手术治疗来达到此 目的。 PVR与RPE细胞的密切关系已被广泛证实，PVR的治疗也是从RPE细胞入 手，通过抑制RPE细胞移行、增生、纤维膜收缩，促进其凋亡来达到治疗目的。’ 郑州大学2005年硕士毕业论文 郑州大学2005年硕士毕业论文 摘要 该疾病的药物防治一直是眼科研究的主要课题之一，因此如果寻找更好的药物干 预，抑制RPE细胞的过度增生以及诱导其凋亡，对抑制PVR形成和降低其术后复 发率有重要意义。 三氧化二砷是中药砒霜的有效成分，其已被成功应用于临床治疗急性早幼粒 细胞性白血病，取得了显著疗效。三氧化二砷作为一种抗肿瘤剂其作用机制是通 过改变细胞正常染色体结构，抑制细胞所含巯基酶活性，改变细胞线粒体通透性， 干扰细胞代谢，可诱导肿瘤细胞凋亡。近年关于三氧化=砷治疗实体瘤的研究报 道很多，实验证明三氧化二砷能诱导多种实体瘤细胞株的细胞凋亡，同时发现对 过度增生的正常细胞，如血管平滑肌细胞、血管内皮细胞等亦有凋亡诱导作用， 展示了广阔的临床应用前景。但目前国内外尚未见到用其防治PVR的研究报道， 本实验首次观察了三氧化二砷对体外培养的人RPE细胞的增生抑制及凋亡诱导作 用，并观察了不同生长状态下的人RPE细胞对三氧化二砷的药物敏感性，为使用 该药物进行下一步实验及在临床眼科局部应用该药物防治PVR提供实验数据。 材料和方法： 1．细胞培养取意外死亡者死亡后12小时内作为角膜移植的供体眼，按常规 方法收获RPE细胞，即沿赤道剪除眼前节及部分玻璃体，在解剖显微镜下剥离视 网膜神经上皮层，暴露出RPE层；用D．Hanks液洗涤眼杯2～3次，加入终浓度 为0．02％EDTA和0．25％胰蛋白酶的混合液，置于37℃孵箱中消化30分钟～1小时。 取出眼杯，轻轻吹打，收获RPE细胞悬液，加入20％胎牛血清的DMEM终止消 化；以1000r／min离心5分钟，弃上清液，将细胞混悬于含20％胎牛血清的DMEM 中。将细胞接种于25mi培养瓶，置饱和湿度、37*(2、5％C02孵箱培养，4天后换 液，待细胞融合后，按1：3传代。传代细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液培 养。选择第3撕代细胞用于实验。用鼠抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色进行细 胞鉴定。 2．实验药物选用三氧化二砷注射液(arsenic trioxide，As203)：哈尔滨伊达制 药有限公司产品。 3．细胞形态学观察倒置显微镜下观察人RPE细胞的形态学变化，并照相记 录。 4．体外药物敏感性实验一四唑盐(MTT)比色法取对数生长期细胞，用2．5以 ¨ 郑州大学2005年硕士毕业论文 郑州大学2005年硕士毕业论文 摘要 胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为4~5×1041mi接种于96孔培养板 中，每孔体积200／fl。血清组常规培养24h，无血清组对照组细胞基本融合后，更 换生长培养液，分别更换为含10％胎牛血清的DMEM培养液和不含血清的纯 DMEM培养液，加入As203使其终浓度分别为O、1．56、3．12、6．25、12．5、25、 5吮mol／L。每个浓度设3个复孔。血清组分别培养24h、48h、72h，无血清组培养 48h，每孑L加入MTr20,ul(5mg／m1)，再培养4小时，弃