利用杆状病毒在昆虫细胞内表达斜带石斑鱼促性腺激素及其生物活性分析-生理学专业毕业论文.docxVIP

中山大学博士学位论文 中山大学博士学位论文 崔淼 论文题目：利用杆状病毒在昆虫细胞内表达斜带石斑鱼促性腺激素 及其生物活性研究 专 业：生理学 博士生：崔淼 指导老师：林浩然院士 摘要 斜带石斑鱼(epinephelus coioides)，属鲈形目Pereiformes、箱科Serranidae、石 斑鱼亚科Epinephelinae、石斑鱼属epinephelus，主要分布在沿海近礁水域，为雌 性先熟的雌雄同体鱼类，是目前我国沿海地区重要的海水养殖经济鱼类。但目前 对斜带石斑鱼生长发育及繁殖的内分泌调控机制缺乏深入系统的研究，石斑鱼在 养殖过程中人工繁殖及促生长问题尚未得到很好的解决。本文根据已知斜带石斑 鱼促性腺激素cDNA序列，利用杆状病毒一昆虫细胞表达系统对斜带石斑鱼促性腺 激素进行体外重组，并对重组斜带石斑鱼促性腺激素(gonadotropin Hormone，GTH) 的生物活性进行研究，以期对鱼类促性腺激素基因的结构与功能有进一步的了解， 为开展鱼类促性腺激素的生理作用及作用机制研究打下基础，并为进一步研究石 斑鱼生长和繁殖的神经内分泌调控机制提供理论依据。本研究的主要内容及结果 如下： 1．采用RT-PCR法从斜带石斑鱼脑垂体克隆出促性腺激素GTHc￡、GTH IB和 GTH II[3亚基并构建了斜带石斑鱼促性腺激素单个亚基cDNA转移质粒载体 pFB—HT-A-GTH IIp、pFB-l—GTH IIp、pFB-HT-A-GTH Ip、pFB一1·GTH Ip、 pFB．HT．A-GTHct、pFB-1．GTH or,和双亚基pFB—GTH I和pFB—GTH II共8种重组 杆状病毒转移载体。pFastBac质粒是一种氨苄青霉素抗性供体质粒，含有杆状病 毒特异性启动子与庆大霉素乙酰转移酶基因以及两个Tn7转座位点，需要表达的 外源基因在多角体蛋白启动子作用下能够转染杆状病毒穿梭载体。采用特异性引 物的多对组合对多个克隆进行了PCR鉴定，均出现了与预期值相符合的带。之后 利用杆状病毒在昆虫细胞内表达斜带石斑鱼促性腺激素及其生物活性研究通过酶切以及DNA序列测定进行进一步鉴定。对四次PCR鉴定都为阳性的三个 利用杆状病毒在昆虫细胞内表达斜带石斑鱼促性腺激素及其生物活性研究 通过酶切以及DNA序列测定进行进一步鉴定。对四次PCR鉴定都为阳性的三个 克隆进行多个组合的双酶切鉴定，结果均符合预期的酶切图谱；测序结果与 GeneBank上登录的一致，氨基酸序列正确，表明斜带石斑鱼促性腺激素重组杆状 病毒转移载体构建成功。 2．对上述8种斜带石斑鱼促性腺激素重组杆状病毒转移载体进行转座反应， 并得到相对应的杆状病毒穿梭质粒载体(Bacmid)。Bacmid是大肠杆菌DHl0BAc 的一个大质粒(136Kb)，含有Tn7靶位点mini．aaTn7和卡那霉素抗性基因。重组的 质粒转染大肠杆菌DHl0BAc感受态细胞时，在含有四环素抗性基因和转座酶基因 的助质粒的协助下，pFastBac质粒与Bacmid发生位点专一性转座，之后通过蓝白 斑筛选转化子，分离制备高纯度Bacmid DNA。对阳性克隆通过PCR验证，实验 结果与预期值符合。Southern杂交中重组Bacmid DNA呈杂交阳性，说明转座反 应成功。 3．在Sf-9昆虫细胞中表达重组了斜带石斑鱼促性腺激素。于28℃培养昆虫细 胞Sf-9至对数生长期，利用Cellfectin混合高纯度Bacmid DNA共转染昆虫细胞Sf-9， 获得重组病毒。继续感染昆虫细胞2．3轮，可获得高滴度重组病毒。以适量重组病 毒感染昆虫细胞Sf-9，利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中表达相应的重组蛋 白，其表达量随时间增加而增强，存在时间梯度。SDS—PAGE、PAGE以及Western Blot分析鉴定重组蛋白表达正确。蛋白电泳分析结果表明重组蛋白表达量占细胞 可溶性蛋白质的15％左右。 4．采用性腺静态孵育，放射免疫测定方法检测重组斜带石斑鱼促性腺激素的 生理活性，结果表明重组蛋白对性类固醇激素(testosterone(T)、17p．estradiol(E2)) 的分泌有明显的促进作用。斜带石斑鱼性腺组织碎片放于M199孵育液中预孵育 18—24小时后，加入不同浓度的重组蛋白(0．5，2．5，5和10 rtg)和hCG(1，10， 100和l 000 IU)，在孵育2，6，12和24小时取孵育液离心测定性类固醇激素(T、 E2)的含量。其中2．5“g GTH II、GTH I、GTH IIl3、GTH Ip处理组在浓度上表现 出效果最好，因此可以推定其为最佳浓度；在处理时间上，12小时为最佳时间。 作用效果依次为GTH I、GTH II、GTH IB和GTHⅡp，而