利用IVIAT技术筛选鸡白痢沙门菌体内感染相关因子及pSPI12质粒的鉴定与IpaJ蛋白的功能分析-人兽共患病学专业论文.docx

利用IVIAT技术筛选鸡白痢沙门菌体内感染相关因子及pSPll2质粒的鉴定与IpaJ蛋白的功能分析1利用IVIAT技术筛选鸡白痢沙门菌体内感染相关因子 利用IVIAT技术筛选鸡白痢沙门菌体内感染相关因子及pSPll2质粒的鉴定与IpaJ蛋白的功能分析1 利用IVIAT技术筛选鸡白痢沙门菌体内感染相关因子 及pSPll2质粒的鉴定与IpaJ蛋白的功能分析 研究生：李求春 导师：焦新安教授 中文摘要 鸡白痢沙门菌多侵害20日龄以内的幼雏，引起白色下痢，病死率极高。成年 鸡感染后虽然不会出现典型的临床症状，但是长期处于带菌状态。在成年鸡的脾 脏和生殖道内，细菌可以存活40周以上。在性成熟时期，细菌能侵入卵巢和输卵 管，垂直传播给下一代。由于该菌能水平传播和垂直传播，对养禽业可造成极大 的危害。目前，在西方发达国家该病已经被消灭或基本消灭，然而在个别小的禽 群中仍有发生，国内禽群鸡白痢的爆发仍较多。寻求鸡白痢沙门菌的致病基因对 于了解其致病机理及有效地防治鸡白痢具有重要的意义。本研究运用ⅣⅪ(伽vivo induced antigen technology)筛选和鉴定了鸡白痢沙门菌的感染相关因子，为全面 认识鸡白痢沙门菌的致病机理提供了基础。 沙门菌毒力质粒在细菌致病过程中发挥着重要的作用，本研究从鸡白痢沙门 菌分离鉴定了一个新的质粒pSPll2，并分析了该质粒上唯一的毒力相关基因ipaJ 的功能，为深入了解细菌早期的感染机制提供了有利的材料。 1．鸡白痢沙门菌S06004基因组表达文库的构建 作为禽的主要病原菌之一，鸡白痢沙门菌的致病机理仍不是很清楚。本实验 采用IVIAT(体内抗原诱导技术)筛选鸡白痢沙门菌的体内感染相关因子，以了解 细菌体内的基因表达情况。首先，要构建鸡白痢沙门菌的基因组表达文库。将 S06004的基因组用Sau3AI酶切后，回收大小在0．1 kb．4 kb的片段。同时用BamHI 酶切原核系列表达载体(pET30a,b，c)，去磷酸化后，回收线性载体片段。将基因 组酶切的片段按适当的比例与原核表达载体连接后，转化大肠杆菌DHSa，挑取部 分转化子，液体培养后提取质粒，用载体特异性引物分析插入片段的大小分布和 片段的插入率。然后从平板上提取质粒，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建 2 2 扬州大学博士学位论文 了S06004基因组的原核表达文库。 2．利用MAT技术筛选鸡白痢沙门菌的感染相关因子 获取了十份感染了鸡白痢沙门菌的阳性血清，混合后分步与S06004体外培养 状态下表达的抗原结合去除相应的抗体，同时利用间接ELISA检测吸附效果。然 后将经过吸附处理的血清与S06004基因组表达文库进行免疫筛选，经初次筛选和 二次筛选以后，共筛选出45个阳性克隆。对阳性克隆测序后，分析其中所包含的 蛋白序列。筛选获得的蛋白涉及生物大分子合成和代谢、转运蛋白、调控因子、 能量代谢相关蛋白及功能未知蛋白等，反映了细菌在体内感染过程中，除毒力基 因的表达外，细菌需要表达相关蛋白维持正常的生长代谢和应对体内不断变化的 体内环境，为揭示细菌的体内活动提供了依据。 3．实时荧光定量PCR检测鸡白痢沙门菌S06004感染相关因子的体内 外表达差异 根据IVIAT筛选获得的阳性克隆的序列和蛋白序列同源比对结果，设计了11 对S06004感染相关因子(WAY,∥国、p助C、stbC、如被、emrB、dapA、phoQ、 trkH,adhE、yhaN)的检测引物，同时以鸡伤寒沙门菌gmk基因作为内参。提取 鸡白痢沙门菌S06004体外液体LB培养的总RNA，反转录成cDNA；以SPF鸡为 动物模型，采用静脉注射的方式将体外培养的S06004细菌免疫，感染后在不同时 间段采血，从血液中收集细菌，提取总RNA，反转录成eDNA，利用荧光定量PCR 比较感染因子在体内外培养时mRNA的表达水平差异。结果表明：个别基因表现 出很高的表达量，如phoQ；部分基因表达呈持续上升趋势如gatD；traY,dapA、 如oR、emrB和trkH呈先升后降趋势；adhE、pbpC和s晒C呈下降趋势；yhaN呈 先降后升趋势。反映了各感染相关因子在体内感染不同时间段mRNA水平并不一 致，其表达水平相对于体外培养时有不同程度的上调。 4．鸡白痢沙门菌pSPll2质粒的分离与序列分析 利用抑制差减杂交的方法，构建了鸡白痢沙门菌与肠炎沙门菌的差减文库， 筛选获得了鸡白痢沙门菌的特异核苷酸序列。部分序列拼接形成勿衫基因与猪霍 乱沙门菌C500减毒株质粒pSFDl0中的ipa,l高度同源。为了验证鸡白痢沙门菌ipaJ 基因是否存在于类似的质粒上，我们将卡那霉素抗性基因插入鸡白痢沙门菌 S06004株的ipaJ基因中，构建了插入突变株SIMl2。从突变株中提