轮状病毒不同基因型间交叉反应研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 中国医学科学院／北京协和医学院博士研究生学位论文1．细胞系和毒株 中国医学科学院／北京协和医学院博士研究生学位论文 1．细胞系和毒株 一25 2．主要试剂及耗材 ．．25 3．主要仪器 ．．26 二实验方法 ．27 1。MAl04细胞在96孔细胞培养板中的培养 27 2．轮状病毒感染性滴度的测定(免疫荧光法，以CCID50表示) 27 3．轮状病毒基因组RNA的提取 29 4．逆转录PCR(RT．PCR)扩增轮状病毒基因组RNA 一29 5．轮状病毒基因组RNA逆转录PCR(RT．PCR)产物的琼脂糖凝胶电泳 ．30 6．轮状病毒基因组RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ．30 三实验结果 ．3 1 1．轮状病毒感染性滴度的测定(免疫荧光法，以CCID50表示) 31 2．轮状病毒基因组RNA逆转录PCR(RT．PCR)产物的琼脂糖凝胶电泳 ．33 3．轮状病毒基因组RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ．34 四讨论 ．34 五小结 ．37 第三部分单价和多价轮状病毒免疫原免疫效果的比较与评价 39 一实验材料 ．39 1．细胞系和毒株 一39 2．主要试剂及耗材 ．．39 3．主要仪器 一40 4．实验动物 ．．40 二实验方法 ．41 1．轮状病毒免疫原免疫实验动物 ．．41 2．检测用血清样本的制备 ．．41 3．ELISA检测血清轮状病毒特异性IgG抗体水平 ．．4l 4．MAl04细胞在96孔细胞培养板中的培养 42 5．中和试验检测血清轮状病毒特异性中和抗体滴度 ～42 万方数据 中国医学科学院／北京协和医学院博士研究生学位论文6．轮状病毒免疫后血清IgA浓度的检测 中国医学科学院／北京协和医学院博士研究生学位论文 6．轮状病毒免疫后血清IgA浓度的检测 ．43 7．统计学分析方法 一44 三实验结果 ．45 1．轮状病毒免疫原免疫实验动物 一45 2．ELISA检测血清轮状病毒特异性IgG抗体水平 一46 3．中和试验检测血清轮状病毒特异性中和抗体滴度 ．．53 4．轮状病毒免疫后血清IgA浓度的测定 ．61 四讨论 ．．67 五小结 ．75 展望 ．．77 参考文献 一79 附录 一87 致谢 一93 独创性声明 一95 万方数据 中国医学科学院t：11：京协和医学院 中国医学科学院t：11：京协和医学院 博t：研究牛学位论文 摘要 轮状病毒(Rotavirus，RV)是世界范围内导致婴幼儿严重腹泻的主要原因。每 年大约有60万左右的婴幼儿因轮状病毒的感染重症发病而死亡，其中80％以上发 生在亚洲南部、非洲南部等经济及卫生条件相对落后的发展中国家和地区，轮状病 毒造成的胃肠炎在世界各国都有不同程度的经济与疾病负担。目前尚无治疗轮状病 毒感染的特效药物，使用疫苗是预防和控制轮状病毒感染，降低重症死亡率的最经 济有效的手段。 轮状病毒基因组由ll条片段组成，分别编码6个结构蛋白(VPI．VP4与 VP6．VP7)和6个非结构蛋白(NSPl-NSP6)。到目前为止，根据结构蛋白VP6(组 抗原)可以分为A～H 8个不同的组，其中引起婴幼儿感染的主要是A组轮状病毒。 另外，依据结构蛋白VP7(G型抗原或糖蛋白)和VP4(P型抗原或蛋白水解酶敏 感蛋白)间的基因差异分为27个G基因型(GI．G27)币U 35个P基因型(P[i卜P[35])。 疫苗研发的型别选择主要是依据流行型而定。已有3种轮状病毒减毒活疫苗用于预 防轮状病毒感染，分别是葛兰素史克公司生产的单价人轮状病毒疫苗Rotarix(基因 型为G1P[81)，默克公司生产的五价人．牛重组轮状病毒疫苗RotaTeq(基因型为Gl， G2，G3，G4，G6和P[8】)以及由兰州生物制品研究所研发的单价轮状病毒IS]服活 疫苗罗特威(基因型为G10P[12】)。 现有的轮状病毒疫苗有单价和多价，这两种疫苗在制备工艺及质控方面都有所 不同．多价疫苗相对困难。因此，单型能覆盖多型的尽可能用单价疫苗。而问题在 于能否用单价疫苗获得多价疫苗的效果，从目前研究的结果表明，尚不能确定其否。 尽管最终的效果取决于人体免疫后的资料，但人体资料的获得周期长，评价体系复 杂。因此，建立实验室评价方法对考虑上述问题具有重要的指导意见和前瞻性。 本课题研究旨在对单价和多价轮状病毒免疫原的免疫原性进行比较，评价单价 免疫原引起的交叉保护作用与多价免疫原间的差异。本课题研究选取三种不同基因 型的轮状病毒标准株：Wa(基因型为G1P[8】)，SAIl(基因型为G3P[I])和Gottfried (基因型为G4P[61)，这三株轮状病毒标准株单独作为单价轮状病毒免疫原，将这 三株轮状病毒标准株按照不同的比例进行混合制备成多价轮状病毒免疫原。实验动 物ICR小鼠随