利用遗传工程方法构建高产甘油酿酒酵母菌株-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要作为一种重要的工业原料，甘油在生产中具有广泛的应用。发酵法生产甘油 摘要 作为一种重要的工业原料，甘油在生产中具有广泛的应用。发酵法生产甘油 具有清洁安全等特点，越来越多地得到人们的关注。本文通过以下三条途径提高 酵母发酵过程中甘油的产量：(1)缺失编码调节甘油跨膜运输的蛋白Fpslp的 删基因的N-末端区域；(2)缺失编码3一磷酸甘油脱氢酶的G阴眩基因；(3)缺 失编码线粒体外部NADH脱氢酶的两个同功酶的朋91E．『和朋啦基因。其中(2) (3)途径均为切断胞质NADH的线粒体呼吸链氧化反应。本文以野生型酿酒酵 母菌株12．1为出发菌株，利用一步基因置换法缺失G【，砣、删和^泐磁，利用 两步基因置换法部分缺失F筒，利用遗传学原理通过不同基因型酵母细胞的融 合及等位基因的分离及遗传分析对F：船，，GU7，2，加疆j，加)酗四个基因修饰进行 组合，得到了15株不同的突变菌株。 对重组菌株12一l，12—1一蜀舾J△)，12-1-龟渤J△，影f．2△??佝豫功，12-1一伍12(本坫J△， 施仫：?唧嘲，磁B2△?：仰e口f)和12-l-蜀乳12(殍孵论，秽f．2A??仰e口f，力如丛：?唧8甜， 万如2△??唧刎进行发酵实验和表型实验，结果显示，12-1一自弘12不能利用甘油为 唯一碳源生长，而能更好得利用乙醇作为唯一碳源生长。与野生型相比， 12．1却12在葡萄糖耗尽后，仍然可以生长并继续生产甘油，其甘油产量从12h 到24h持续增高；而12．1．f在葡萄糖耗尽后则主要利用甘油进行生长，其甘油产量 在12h达到最高，24h后甘油产量明显降低。12．1．龟，12．1二伍12也一定程度地提高 了甘油产量。总之，缺失Fpslp 75．230的氨基酸残基使甘油运输通道失控，对甘 油的摄取与利用具有～定的促进作用；而将用聊的N端区域、G观2，删、舰 同时缺失可以切断摄取利用甘油进行生长的通路，并促进乙醇的摄取利用，从而 提高甘油产量。 关键词：酿酒酵母甘油生产剧)J钳G￡，j陀^∞E7凇 ABSTRACTGlycerol ABSTRACT Glycerol is觚imp删．肌t gre铋chemical锄也due t0 its cle锄ess and saf．e劬 production 0f glyc啪l by miCrobial fe】m纰tion h舔‰more觚d m1)re attention． 111 tllis study也e following 3 g∞e矗c s眦e酉es were唧loyed t0 incre勰e the glycerol production in硇拍册彬班鬻艿c曰研咖地P：(1)lmocking out the N-terminal domain of 用略J，which encodes a ch锄e1 protein mediating glycer01 export；(2)knocking out G们r2，w11ichencodes a key en巧me of the glycerol-3-phosphate shume；(3)knocking 0ut肋口锄d脚2，砌ch encode也e锕o iso唧es of mitochondrial ext锄al NADH dehydroge舰se．Deletion of N-terIninal domin of忍钳resulted in a constitutive open ch锄el and s眦gy(2)趾d(3)cut off tlle mitochondrial oxi蛳on of cytosolic NADH in Isb∞梳彬)，，cI嚣c臼z豳Z口孥． Starting wi也鼬嘶n 12-1，a haploid progeny of an indl蚓匝al ye嬲t s仃ain，we cr《强ted a set of reconlbinant s仃ains慨c秭es dif】；Ierent or dia’e110nt conlbination of the nuU allele of t11e genes desc曲ed above．Gr弧恤exp嘶mentS粕d ae】rolbic fem倒拍0n of 12—1，12—1一f渤论)，12-l—f窑(秘丛，gz，六猃??唧阳力，12—1-血12(秘J△， 弧del＆：：repe瓯埘e2氏：：repe确锄嗵、2-1-龇2饰s1＆，蹦t2厶：：repem，确el厶：：repem， 刀如2△??仰刎were perf．0m坳d．Tlhe results sh0、耽d nlat 12-l-f扣12 can not utilize glyc哪l f．0r its伊D、)l，t11