扇贝微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用-生态学专业论文.docxVIP

扇贝微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用扇贝微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应甩 扇贝微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用 扇贝微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应甩 摘要 扇贝作为重要的经济贝类，其养殖业被迅速的开展起来，逐渐成为我国重要 的增养殖贝类，而飞速发展的分子标记辅助育种体系为优良品种的快速培育提供 了理论基础和实践经验。微卫星标记作为一种新兴的分子标记技术，加之其自身 的优点，在扇贝遗传分析上的应用也日益得到重视。本研究以四种扇贝(栉孔扇 贝、海湾扇贝、华贵栉孔扇贝和虾夷扇贝)为研究材料，筛选了四种扇贝的微卫 星标记并对微卫星标记在扇贝肌肉柱和幼虫鉴定中的应用进行了探讨。 1栉孔扇贝微卫星标记的筛选 搜索NCBI dbGSS数据库，得到栉孔扇贝序列3648条。用软件“Repeat Reporter Versionl．5查找得到核心序列为三碱基、四碱基的微卫星序列。经序列 比对和引物设计、优化以及多态性检测后，共筛选得到24个具有多态性的标记， 等位形式在2—9之间，平均等位形式数目为5．1。凰和总的范围各自为0．000 --0．7500和O．1866一O．8495，各位点之间没有明显的连锁不平衡现象，经Markov chain test检验24个位点中有12个偏离Hardy--Weinberg平衡。 2海湾扇贝微卫星标记的筛选 搜索NCBI dbEST数据库中所有栉孔扇贝的EST序歹1J7060条，并用软件搜索 了所有可能的核心序列为两碱基、三碱基、四碱基、五碱基及六碱基的微卫星序 列，结果193条序列符合严谨度，占整个ESTs库的2．73％。其中：两碱基重复含 量三碱基重复五碱基重复四碱基重复六碱基重复。两碱基重复的 微卫星含量最高的是(AT)。，其次是(AG)n，再次之为(AC)。。最后筛选 得到20个多态性引物，共扩增得到92个等位基因，每个位点扩增得到的等位基因 个数为2—11个，平均每对引物扩增出4．6个等位形式。观测到的杂合度和期望杂 合度范围分别为o．0667--0．8000和0．0961--0．8253。 3华贵栉孔扇贝微卫星标记的筛选 以华贵栉孔扇贝为材料，基因组DNA经Rsa I进行酶切，经过膜富集(AC)n和 (AG)。后构建了华贵栉孔扇贝微卫星富集文库。运用菌落原位杂交的方法，使用 (AC)。和(AG)。为探针经过杂交后，筛选得到阳性克隆，经测序共获得T60个华贵 栉孔扇贝的微卫星序列，设计的22对引物中，10对引物的扩增产物具有多态性， 扇贝徽卫星标记的筛选及蕊在物种鉴定巾的应用等位基因数目麸3至t16个不等，平均等位形式数舀为4．2，观测杂合度鞫期望杂念 扇贝徽卫星标记的筛选及蕊在物种鉴定巾的应用 等位基因数目麸3至t16个不等，平均等位形式数舀为4．2，观测杂合度鞫期望杂念 度从O—O．88朔0，29一O．76。． 4虾夷扇贝微卫星标记的筛选 同上震富集文库的方法《搿如Ill≥筛选垂下夷扇贝的微卫星标记，筛选褥至l的 12个多态性位点中，扩增褥到的等位基嚣觖2个到8个不等，平均每个位点褥 爨莲。5个等位基嚣。耀测剖戆杂食发灌委失0一§．8333，翥塑杂合度莲鋈舞0。2546 --0。8231。以上表踢，这些微型星掭记都其毒较高瓣多态性，均具有较高的信息 含鬣，适合进行各静遗赞学分耩。 S物种特异性微卫星标记的筛选及爱敏度检测 本研究共采用了72个微卫星标记进行物种特异性标记的确认。最后选取了 8个在任何温度下只能在爵的物种中扩增得蓟DNA片段的标记作为茶定用标记。 用幼虫进行灵敏度裣测，结粟显示蠢标记鹃捻测灵敏度非常离：为2％帮l繇， 该标记系统蠹缡煲豹物魏鉴定以及生态学调查提供了实验俊援。 6扇烫飘逡柱及幼虫鉴定 本研究剥用越上8个标记组成瓣鉴定系统对三耪产品(冷冻、干品和罐头) 的7批样品进行了鉴定。结果显示，6批次的样晶分别是单一物种组成的。其中 编号为DM3的样品经过WAVE检测后发现，此批样箍是栉孔扇贝和海湾扇贝的 混合物。单个模板扩增的PAGE检测结果显示其中4个样品是栉藐扇贝，16个 样品为海湾赢哭，因此，我们可虢基本确定此羲|：样晶孛栉魏翕哭移海湾扇贝酶所 占的善分比分别尧20％氍80％。实验没有捡测到华贵释孑乙赢爨样品。 黠予杂交幼虫豹鉴定，结果曼添：舞有然养殪场敬褥麴l§撬群晶全都在巢 一物耱处出现条带或者检溅峰，说骥样品审麴杂样应该低予|％(灵敏度)。反复 取样的结粜显示厥鸯鲢幼虫都是由单一物种组成的。实验随机选取了4批大池幼 虫，从中馑意挑选至少72个个体进行单一幼虫模板的PCR扩增结果显示336个 幼虫中306(91．1％)个扩增成功，结采最示所有的幼虫都是种内杂交产生。基 于本研巍结果，我翻认为物种特异挂微里璧标记能够在扇贝商品鉴定酾幼虫鉴定 孛发挥