淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中高效表达及其性能的初步研究-营养与食品卫生学专业论文.docx

博士学位论文 博士学位论文 淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中高效表达及其性能的初步研究 淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆 菌中高效表达及其性能的初步研究 博士研究生：占利 导师：张朝武教授 诵 矍 目的：淋病是性传播疾病中最常见、发病率排列第一的疾病；也是我 国最常报道的性病之一，不仅发病人数最多，而且有逐年上升趋势，其感染 还有增力[IHIV易感性的可能。目前常用的抗生素治疗虽然可以缩短淋球菌感 染持续的时间并减少其传播，但近年来淋球菌耐药菌株的增多和新型耐药株 的不断出现，这一策略已经陷入困境和危机，因此迫切需要寻求新的预防和 治疗方法，而疫苗的研究是首选的策略之一。迄今为止，国内外尚无预防淋 病的疫苗问世。最近对奈瑟菌外膜蛋1自NspA的研究发现，NspA具有高度的 抗原保守性，其保守性高于同样是淋球菌候选抗原的PI蛋白。NspA蛋白持续 表达暴露在细胞表面，诱导产生的抗NspA抗体有溶菌活性，因此，NspA是 一个潜在的制备淋球菌疫苗的候选抗原，可望用于制备成防治淋病的疫苗。 本研究通过扩增淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)外膜蛋白nspA (Neisseria surface protein A)基因，构建pET-NspA重组子，实现NspA重组 蛋白在大肠杆菌中的高效表达，通过金属离子亲和层析纯化表达蛋白，免疫 动物获得多克隆抗体血清，并对抗血清的性质进行初步研究，为后续研究淋 球菌NspA薛2免疫学性能、相应的抗体制备及疫苗的研制奠定了基础，特别是 为研制适合我国流行情况的相关疫苗奠定了坚实的基础。 方法：本研究分为三部分。 1．淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)外膜蛋白NspA原核表达质粒的 构建及序列分析根据nspA基因序列特性，设计三套引物，用PCR方法自 淋球菌基因组中扩增nspA目的片段。利用限制性内切酶剪切产生的粘性末 端将扩增所得片段与原核表达质粒载体pET 30c(+)连接，构建重组质粒 博士学位论文 博士学位论文 淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中高效表达及其性能的初步研究 pET-NspA，首先转入克隆宿主E．coli DH5a，利用卡那霉素抗性筛选阳性克 隆，质粒小量提取后，双酶切及基因序列测定鉴定重组质粒。用blastn软件 将测定所得的阳性重组子的基因序列与Genbank数据库中序列进行同源性 比较，寻找相似序列；用DNAssist 2．0软件进行2条淋球菌标准株nspA基 因序列间的同源性比较，分析淋球菌标准株29400和29403与Genbank已报 道的淋球菌nspA基因序列间差异；同时使用blastp软件在Genbank中搜索 与本研究中2条序列的氨基酸序列高度同源序列，并比较两淋球菌NspA氨 基酸序列间的同源性。利用相关生物软件分析所构建的三套重组子的开放读 码框架(ORF)并fl预期分子量(MW)，使用RasWin Molecular Graphics Windows Version 2．6、SWISS—MODEL等蛋白质结构预测软件预测NspA蛋白的二级 结构和三级构型。将所得预测结果与已有研究结果进行分析比较，分析所得 融合蛋白的立体构象及其暴露于膜外的抗原决定簇的几种loop结构区，为下 一步研究奠定理论基础。 2．NspA融合蛋白的表达及纯化第一部分所得重组质粒pET-NspA转 化表达宿主菌E．coli BL21(DE3)，IPTG诱导NspA重组蛋白表达，优化重组 蛋白的表达条件，SDS．PAGE分析目的蛋白的表达情况；筛选溶解包涵体的 条件和获取融合蛋白粗提取物条件，选择镍金属离子亲和层析对NspA重组 蛋白进行纯化，优化离-tl,法纯化重组蛋白各项条件，SDS．PAGE检测重组蛋 白纯度及其分子量；使用抗His．Tag标签的单克隆抗体以Western blot法鉴定 诱导表达的重组NspA蛋白。 3．淋球菌外膜蛋白NspA融合蛋白的免疫原性研究根据第二部分筛 选的镍金属离子亲和层析纯化NspA重组蛋白的条件，大量纯化目的重组蛋 白，SDS．PAGE检测重组蛋白纯度及其分子量；选择新西兰大白兔和ICR小 鼠，按如下方式制备两种动物源性的多克隆抗血清。常规免疫方法，腹腔注 射方式免疫ICR小鼠；常规免疫方法和快速免疫方法，以皮下多点注射方式 免疫新西兰大白兔。加强免疫三次后试血，效价达到要求后，心脏采血方式 收集兔血清，眼球摘除法收集小鼠血清。多克隆抗体的效价用间接ELISA 方法测定：以Western blot法检测多克隆抗体的反应性。所收集血清在加入 0．02％NaN3后小管分装，于．70℃保存。 结果： 4 博士学位论文 博士学位论文 淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中