山羊原始生殖细胞的分离培养-动物遗传育种与繁殖专业论文.docxVIP

山羊原始生殖细胞的分离培养 山羊原始生殖细胞的分离培养 研究生：熊浩 导师：王杏龙教授 (扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009) 摘 要 原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)在一定条件下维持未分化状 态，经过体外长期培养可以建立胚胎性干细胞系，称为胚胎生殖细胞(Embryonic Germ Cells，EGCs)，这是继胚胎癌细胞(Embryonal Carcinoma Cells，ECCs)和 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)之后发现的又一多能性干细胞。本研究 以江苏本地白山羊胎儿的生殖嵴为实验材料，从PGCs中分离培养得到EGCs， 对其进行体外传代和鉴定等，并且分析了影响山羊PGCs分离培养的一些因素， 为本地白山羊ESCs系的建立奠定了一定的基础。实验结果如下： 1．小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast cells，MEF)，山羊胎儿成 纤维细胞(Goat embryonic fibroblast cells，GEF)和小鼠睾丸支持细胞(Mouse sertoli cells，MSCs)三种细胞在体外生长行为基本相似，贴壁时间短，增殖迅速。 试验发现以10,g／mL丝裂霉素．C处理3 h可以有效抑制GEF的增殖，适宜于饲 养层的制作；在短期内冻存GEF可以置于．70。C保存，复苏率可以达到培养要求。 2．原始生殖细胞在体外培养生长呈鸟巢状和集落状，凸起生长于成纤维细胞饲 养层之上，传代后EGCs的形状与PGCs基本相似。 3．以共培养，MEF和GEF作为饲养层的三种培养方式中：在培养基中没有添加 细胞因子时，仅仅能够观察到原代集落；在培养基中添加10 ng／mL的LIF时， 只有以GEF为饲养层才能将得到的原代集落传至二代，其它二种培养方式仅仅 可以观察到原代集落。以MSCs为饲养层时，添加细胞因子与否均无法观察到原 代集落。 4．胎儿生殖嵴在室温(25℃)下消化15 min，使用0．125％胰酶+0．02％EDTA要比 110．25％胰酶+O．04％EDTA效果好，前者消化得到的原代集落要多于后者，差异显 11 0．25％胰酶+O．04％EDTA效果好，前者消化得到的原代集落要多于后者，差异显 著(PO．05)：试验比较了两种传代方法对山羊PGCs传代的影响，无论是“挑取 集落法”还是“胰酶消化法”，均能将PGCs传至第二代，两种方法差异不显著 (尸0．05)。 5．在培养液中添加不同浓度和种类的因子：①LrF：10 ng／mL；(室)LIF：20 ng／mL；③LIF(1 0 ng／mL)+SCF(1 0 ng／mL)；@LIF(20 ng／mL)+SCF(20 ng／mL)， 以GEF为饲养层，发现这四种培养方式对于原代集落形成率的差异是不显著的 (尸O．05)，且均能得到传至第二代的EGCs。 6．不同胎龄胎儿分离培养PGCs的效果，结果发现4例冠臀长小于15 lnm的胎儿 仅观察到一个原代集落，6例大于30 rnlTl的胎儿没有观察到原代集落。 7．本试验对山羊第二代EGCs进行冷冻保存，复苏没有获得成功，复苏率为零。 关键词：白山羊；胚胎干细胞；原始生殖细胞；分离培养 IIIISOLATION III ISOLATION AND CULTURE OF GoAT PRIMORDIAL GERM CELLS M．S．Candidate：hao xiong Advisor：Prof．Xing—long Wang College ofAnimal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou，Jiangsu， 225009 China； Abstract Under certain conditions，Primordial germ cells(PGCs)maintain the undifferentiated state，which Can be established to embryonic stem ceils(ESCs)lines through long-term culture in vitro，known as embryonic germ cells(EGCs)．EGCs is another pluripotent stem cells following the ESCs and embryonal carcinoma cells (ECCs)．In this study,The fetal genital ridge from Jiangsu local white goat were as experim