少根根霉脂肪酶基因的表达和定向进化研究-生物化工专业论文.docxVIP

少根根霉脂肪酶基因的表达和定向进化研究 少根根霉脂肪酶基因的表达和定向进化研究 摘要 根霉脂肪酶是一类重要的脂肪酶，具有良好的1，3位置专一性和催 化活性。少根根霉(Rhizopus arrhizus L-03．R-1)是经诱变选育的脂肪 酶高产菌株。本论文克隆了该根霉脂肪酶基因，并在大肠杆菌和毕赤 酵母中进行了表达。同时通过定向进化提高了脂肪酶的热稳定性。主 要工作如下： 1．以少根根霉(Rhizopus arrhizus L-03．R-1)的基因组DNA为模 板PCR扩增了少根根霉前体脂肪酶(ProRAL)和成熟脂肪酶(RAL)基因 (Genebank登录号：DQ489719)。对克隆的脂肪酶基因测序后发现， 少根根霉脂肪酶基因与米根霉脂肪酶基因(Rhizopus oryzae．Genebank： AF229435)的基因同源性为96％，氨基酸序列的同源性为97％。这两 种脂肪酶基因序列之间存在36bp的差异，翻译出的蛋白质存在10个 氨基酸的差异。将RAL基因和大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和 pET．22b(+)连接构建了大肠杆菌表达质粒pET．28a-RAL和 pET-22b．RAL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。 SDS．PAGE分析发现含有质粒pET一28a-RAL的重组大肠杆菌表达了重 组蛋白，但是含有质粒pET-22b—RAL的重组大肠杆菌并没有观察到重 组蛋白表达。表达产物菌没有检测到脂肪酶活性。 2．将少根根霉ProRAL和RAL基因分别和毕赤酵母表达质粒 pPIC9K连接，构建了重组酵母表达质粒pPIC9K-ProRAL和 pPIC9K-RAL。酶切鉴定正确后分别使用Sac pPIC9K-RAL。酶切鉴定正确后分别使用Sac I和BgtlI线性化质粒，然 后电转化毕赤酵母GSI 15，得到了大约50000个重组子。通过 YPD—Gcneticin平板(2mg／ml G418)进行高拷贝筛选得至0T56个高拷贝 的毕赤酵母重组子。随机挑取12个转化子提取酵母基因组进行PCR鉴 定表明脂肪酶基因已经整合到酵母基因组上。通过罗丹明脂肪酶活性 筛选得到了8株产脂肪酶活性较高的菌株，同时在MD和MM平板上鉴 定了所筛选卤株的表型。最后通过摇瓶筛选得到了两株表达量较高的 重组酵母菌。在摇瓶中菌株BQI(pPIC9K-ProRAL)和SC77 (pPIC9K-RAL)产脂肪酶活性分别为18U／mL和26U／mL。 3．ProRAL和RAL的发酵液经过超滤、离子交换层析和疏水层析 后，在SDS上为单一条带，分子量分别为32kDa和30kDa。 ProRAL和RAL纯化后的单位酶活分别为1543U／rag和2437Utmg，纯 化得率分别为37％和37．7％。同时对纯化的ProRAL和RAL的糖基化、 温度稳定性、pH稳定性以及底物特异性进行了研究。ProRAL和RAL 均没有被糖基化。ProRAL和RAL的最适反应温度分别为3012和35℃， 最适反应pH值分别为8．0和8．5，ProRAL在酸性条件下活性更高，而 RAL在碱性条件下活性更高。ProRAL的热稳定性略高于RAL。两种 脂肪酶在pH7．0时都最稳定，pH7时ProRAL的稳定性要高于RAL， pH7时RAL的稳定性要高于ProRAL。ProRAL对三已酸甘油酯的活 性最强，而RAL肘三辛酸甘油酯的活性最强。脂肪酶前肽(Prosequence) 序列的存在导致两种脂肪酶性质的差异。 4．在5L发酵罐中对ProRAL和RAL的表达进行了研究。在溶氧 控制下流加甲醇进行诱导表达，BQI经过80h发酵脂肪酶活(ProRAL) 控制下流加甲醇进行诱导表达，BQI经过80h发酵脂肪酶活(ProRAL) 达到72 U／mL，SC77经过92h发酵脂肪酶活(RAL)达到125 U／mL。 由于在ProRAL序列中有1个Kex2蛋白酶的酶切位点，所以ProRAL 是被加工过的蛋白产物，RAL在该培养条件下可能被糖基化。 5．使用易错PCR和DNA该组技术在毕赤酵母系统中对RAL脂肪 酶进行了定向进化研究。在50℃下使用橄榄油平板对大约5500个酵母 重组子进行筛选得到了一个产脂肪酶热稳定较高的菌株。测序发现脂 肪酶基因中有4个碱基被替换(G25A，A569T,A570T,G675C)，推导 出的氨基酸序列有3个氨基酸残基发生突变(A9T,E190V,M225I)。 该突变脂肪酶最适反应温度比野生脂肪酶提高了10(2，在50C下的丁k 值是野生型的12倍。对野生脂肪酶定点突变发现E190(V)位氨基酸的 突变是导致脂肪酶最适反应温度和热稳定性提高的主要原因。同时模 拟了脂肪酶的三维结构，尝试解释了突变脂肪酶最适反应温度和热稳 定性提高的原因