扫描电化学显微镜测定单细胞内的过氧化物酶和纳米电极的应用-分析化学专业论文.docx

山东大学博士学位论文 中文摘要 第一辈首先对扫描电化学显微镜 (SECM) 的实验装霞，工作模式和工作原理进 行了简要的介绍。然后就 SECM 的下述几个方面进行了较 ì，(;细的介绍。1.介绍了 SECM 探头的发展，包括微米和纳米电极，化学修饰电极和生物传感器，微米和纳米 管tE SECM 巾的应用情况囚 2. 介绍了获得 SECM 图像的两种模式(等高模式和等电 流模式)的发展状况。 3.介绍了 SECM 在生物分析方面的应用，包捅 SECM 对酶， 抗原抗体复合物， DNA 以及细胞的研究。本章其引用文献 121 篇。 第二章利用仆CD 与环氧氯丙炕交联聚合物( P-CDP) 在酸性条件下与戊二醒 发生缩聚而形成的不溶于水聚合物，把辣根过氧化物酶 (HRP) 固定在绝缘体基底 上。利用 SECM 的反馈模式研究固态 HRP 酶点上发生的异相催化反应的一级酶催 化反应 ?;lJ 力学。在缓冲溶液中 1，4-苯酿 (BQ) 在 Pt 微盘电极 CSECM 的探头)上 发生可逆电极反应，生成氢酿 (HQ). 当探头逼近酶点时，探头上产生的 HQ 就会 与浓浓巾的 H202 在 HRP 的催化下反应生成 BQ 和水，这样探头 F? 流就会 1fl加， IJ 产生.ir:反锁电流。由于探头上 BQ 的反应很快，探头咆流主要受前异栩 fl 化反应的 控制。通过对 SECM 在酶点上的反馈曲线与理论曲线进行比较，测得了一级酶异 1J !m化反!但 ìili凉jt 数。 证 叨1y刃9J SECM 是研究固态 E酶草点上自酶草{的内 5异元予h斗刷川 f刊位1似1H 化反l应泣动 力J 学的 t 米f削U川J 究肯济辛液夜削{白的|内甘 p肘H川{由i ij(‘.]HRP 活性的影l晌币响D. 实验结果表 IYJ ，HRP 11: pH 7.0 11才活性 fcl: 高， 第三 r :ili 古丁川J SECM 测定州个中性粒细胞中的髓过轼化物附 (MIO) 泪n水 平的方法。 JIJ JíU\ìld巴虫1I)Jí!l.WI lr在找破片上，形成细胞啡店。 .{r充分 lt;{干 0，自IJ!J也I1员 的油 萃111:发 hj(变。主I r?tl仪 1)JII入 MIO 的底物。lQ 和 11202 )们.它们 iiJ 以扩版组11 JI也内 M IO (10t:ifii，)HE MPO 的仰化下发生反应生成 BQ 平11水。 nJ1(I(J!W化反应迷 }J.[ 作，l;nR. J:.J N，(101盯就会 líij持1N主 OJ jJt忱。当探头的 Il!.位怔.(i.E T BQ 友 Uf )j;i反应的 Il!. 仪 111， BQ {I 探头 1.发生 Il!t反反应，生成 HQ 。当探头肌肉纠11I也较l 11.J， IIITrfíH I JJ(.l 极少，所以 Il!.ìlii似小. 1M 当探头移动到纠11)，血 H :ìl.i:M ，山r B(.l r.f JJ.[ 11肉， (1 探头 上检测到较大的还!京电流。因此可以通过检测 MPO 催化反应 JíJirr.生的 BQ 的最来测 定 Iyl个中性粒到IIJJl!l rMPo 的水平。在含有 3.00xl0.3 mol/L lIQ ，3.00x 10.3 mol/L H202 (I :J:.现 tr水巾，切JL 了四个小性粒细胞 MPO 产尘的岭，岭 Il!流1E 4.2-7.0x lOlO A 范 1lJ))、大学 M-J 学位论文 网内，岭体积tt二 3.0-12 10-6 μm2A 范m内.研究农明，冷 ìh，处理严 重;j在响了 MPO(j(J 活性，而阳定过程对酶活性的影响不大，并且固定后的细胞 j供更加l稳定，不易变形. 实现了!日 SECM 测定到llJJ也内的酶. 第四章建立了 SECM 测定了单个活细胞中的能过氧化物酶的方法。首先用 SECM 的收集模式确定了测定 MPO 的最佳条件。在最佳条件含1.00x10-3 mol/L HQ ，; 1.00x10.3 mol/L lh02 的生理盐水得到活性检测限为 6.3x 10-9 :U. 又利用毛地黄皂背 (Dig) 能溶解细胞膜上的胆固酶的性质，在细胞膜上产生微孔。此时细胞内的式分 子(如酶〉仍然被禁 锢在细胞内部，而小分子物质(如酶的底物和 产物) 则可以迸出 细胞。经过 Dig 处理后的细胞仍能存活。这样既保证细胞形态上的完整性，又能用 SECM 来测定细胞内的 MPO. 当浴液中加入 MPO 的底物 (HQ 和 H202 ) 后，它们 可以扩散到细胞内 ，并在细胞内MPO 的催化下发生反应