两个胞外受体蛋白的克隆与黄萎病抗性分析-生态学专业论文.docxVIP

I I 摘 要 黄萎病是一类土传维管束真菌病害，可导致棉花的品质降低，产量大幅减少甚至 绝收。目前对于黄萎病虽然进行了大量研究，但仍未找到可以根治的办法，主要是由 于黄萎病病原菌的致病机制颇为复杂以及抗病种质资源较匮乏。一直以来，转基因抗 病育种都被认为是解决植物病害的有效途径，因此，黄萎病抗性基因的克隆便成为当 前棉花抗黄萎病育种的研究热点。 Ve1 是来源于番茄黄萎病抗性品种 VFN8 的一个表面受体蛋白基因，对黄萎病菌 生理小种 1 具有抗性。本实验根据 Ve1 基因序列从番茄抗性材料中获得该基因，并构 建到由组成型强启动子 CaMV35S 控制的植物过量表达载体 pCAMBIA2301 上，通过 农杆菌介导法将其转入模式植物拟南芥中。经卡那霉素抗性筛选与分子检测，得到转 基因拟南芥 T0 代 5 个植株。对转基因拟南芥 T1 代株系进行了 PCR 和抗病性鉴定。结 果表明，转 Ve1 基因拟南芥株系对棉花落叶型黄萎病原菌 V991 可延缓发病，对 Bp2 的抗性与未转基因拟南芥对比并无显著增强。 本实验通过RT-PCR和Genomewalking发现并获取了一个全新的RLP类黄萎病抗 性基因GhVdr2，该基因来源于高抗落叶型黄萎病的陆地棉品种常抗棉（Gossypium hirsutum L.）。GhVdr2基因全长为3417bp，编码1139aa。尽管GhVdr2基因与Ve1、Ve2 的相似性只有50%，但它与LRR-TM类抗病基因结构类似，同样含有LRR重复单元和 跨膜区。GhVdr2具有11个LRR保守结构域，在N端和C端各有1个跨膜结构域。该基因 受棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的诱导后上调表达。将GhVdr2与CaMV35S启 动子构建植物表达载体转化拟南芥哥伦比亚型植株并接种黄萎病原菌，野生型拟南芥 对照接种15天后叶片明显萎蔫黄化，植物生长迟缓，而转化株虽也出现一定症状，但 仍可正常结实。抗病性鉴定结果显示该基因过量表达可以显著提高拟南芥对落叶和非 落叶型黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的抗性。 关键词：黄萎病；番茄；棉花；Ve基因；GhVdr2基因；转基因拟南芥 I II Abstract Verticillium dahliea is a kind of soil-borne fungal disease, which would seriously destroy cotton production.Although lots of researches working on the Verticillium dahliea were carried out, there were no effective way for disease controlling, because of the complexity pathogenicity of Verticillium dahliae and lacking of resistance gene resources in cotton. Therefore, cloning resistance genes to Verticillium dahliae has become a hotspot in disease resistance transgenic cotton breeding. Ve1, cloned from Verticillium wilt resistant tomato variety VFN8, is a cell surface receptor protein and confers resistance to race 1 of Verticillium wilt. In this paper，Ve1 was cloned from disease resistant tomato variety and inserted into the plant over expression vector pCAMBIA2301 after sequence validation. The recombinant vector was transferred into Arabidopsis by Agrobacterium-mediated transformation method ． 5 transgenic Arabidopsis lines were obtained through kanamycin sulfate screening and PCR method．The T1 plants of these transgenic lines were