CRF01-AE亚型HIV-1感染的MSM患者病毒特异性CTL应答与病毒控制水平关系的研究.pdfVIP

5、DNA提取 外周血DNA的提取，使用lml DNAMini EDTA抗凝外周静脉血，采用QIAamp 试剂盒，按照试剂盒说明书标准方法快速提取全基因组DNA 200I．tl。将纯化后的 DNA置．20℃保存备用。 6、HLA等位基因分型检测 HLA分型采用PCR．SSP方法，采用OneLamda公司的MicroSSPTM试剂盒。 7、Gag克隆 1)HIV-1基因组RNA提取 ViralRNAMini 病毒基因组RNA使用QIAamp 明从血浆标本提取基因组RNA，．80。C保存备用。 2)Nested—PCR Gag基因扩增及TA克隆测序 采用TakaraOne RNAPCR Step Kit(AMV)扩增Gag全长。第一轮外侧引物 HIV-1 1 ntof HXB2) 和 (5。一TA 1-2621ntof Gag一6 HIV-I ntofHIV-1 nt ofHIV-1 rain；94。C HXB2)。扩增条件：第一轮：50。C，30rain；94。C变性5 30s，50。C30s，72。C2min 30s，55。C30s，72。C2rain 3个循环；94。C 32个循环； 30s，55。C30s，72。C 72。C延伸10min：40C保温。第二轮：94。C变性5min；94。C 2min 切下1600bp阳性片段，QIAgen胶纯化试剂盒按照操作说明纯化回收目的基因片 段。纯化产物以40ul去离子水洗脱。将其连接入TOPO载体克隆后获得每一个患 者的Gag序列，并进行测序分析。 8、统计学分析 应用SPSS Utest检验对CD4 17．0进行统计学分析，采用应用Mann—Whitney 计数、病毒载量、setpoint进行分析，P0．05认为有统计学差异。 蛙 旦 皇口 示 3 1、15例样本基本临床信息 本研究共纳入15例新发感染者，均为MSM感染者，且均为CRF01一AE亚型 第二簇。在感染1年点时平均CD4计数和病毒载量较3个月点时均有所下降，但 高。 2、3个月点和1年点CTL应答的特征 通过分析15例患者感染3个月点和1年点不同蛋白的应答频率发现，各区段 蛋白在3个月点的应答频率整体低于1年点时的应答频率，其中P17、P24、RT 和Nef区在3个月点和1年点应答频率均较高，在3个月点这4个区段应答频率 频率相对较低，在3个月点及1年点应答频率均小于30％。通过强度分析发现， 各区段蛋白在3个月点的平均应答强度同样整体弱于1年点时的平均应答强度， P24、RT和Nef区在3个月点和1年点平均应答强度均较强，在3个月点这3个 SFU／106PBMC，在1年点平均应答强度均大于 蛋白区段平均应答强度均大于600 1200SFU／106 SFU／106PBMC。 点和1年点平均应答强度均小于200