当归苯丙氨酸解氨酶基因原核表达载体的构建-甘肃中医药大学学报.PDF

第３５卷 第３期 甘肃中医药大学学报 Ｖｏｌ３５　 Ｎｏ３ ２０１８年６月 　 　 　 　 　 　 　 　 ＪＧＡＮＳＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Ｊｕｎ.２０１８ 论著 当归苯丙氨酸解氨酶基因原核表达载体的构建 １ １ ２ １ 杨　 雪 ꎬ王引权 ꎬ雒　 军 ꎬ杨彩霞 (１.甘肃中医药大学药学院ꎬ甘肃　 兰州　 ７３００００ꎻ２.甘肃中医药大学中西医结合学院ꎬ甘肃　 兰州　 ７３００００) 摘要:目的　 构建当归苯丙氨酸解氨酶(ＰＡＬ)基因原核表达载体ꎬ为重组蛋白的异源表达奠定基础ꎮ 方 法　 以ＰＡＬ基因的全长ｃＤＮＡ序列为模板ꎬＰＣＲ扩增得到ＰＡＬ基因的开放阅读框序列ꎬ利用双酶切、酶连技 术构建原核表达载体ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣３￣ＰＡＬꎬ转化大肠杆菌(Ｅ.ｃｏｌｉ)ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞ꎬ筛选阳性克隆菌株ꎮ 结果　 利用传统的酶切和连接的方法成功构建了ＰＡＬ基因的原核表达载体ꎬ并筛选得到阳性大肠杆菌表达 菌ꎮ 结论　 初步证明传统的酶切和连接技术能够运用于ＰＡＬ基因原核表达载体的构建ꎬ获得的原核表达菌 株用于下一步ＰＡＬ蛋白的表达研究ꎮ 关键词:当归ꎻ苯丙氨酸解氨酶基因ꎻ载体构建ꎻ原核表达 － － － 中图分类号:Ｒ２８５.５　 文献标志码:Ｂ　 文章编号:１００３ ８４５０(２０１８)０３ ０００１ ０４ － ＤＯＩ:１０.１６８４１/ ｊ.ｉｓｓｎ１００３ ８４５０.２０１８.０３.０１ 　 　 当归Ａｎｇｅｌｉｃａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ(Ｏｌｉｖ.)Ｄｉｅｌｓ为伞形科当归 的作用提供理论基础ꎮ 属草本植物ꎬ以干燥根入药ꎬ性温ꎬ味甘、辛ꎬ入肝、心、 [１] 脾经ꎬ具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效 ꎮ 阿魏酸(ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄꎬＦＡ)是当归主要有效成分之一ꎬ 同时也是当归的代谢产物ꎬ具有抗氧化、抑制血小板 [２] 聚集、抗菌消炎等药理作用 ꎮ 研究表明ꎬＦＡ是苯丙 烷代谢途径中生成的中间产物之一ꎬ它的合成首先从 苯丙氨酸解氨酶(ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ￣ｌｙａｓｅꎬＰＡＬ) [３] 催化苯丙氨酸脱氨反应开始 ꎬ具体过程见图 １ꎮ ＰＡＬ是连接植物初生代谢和次生代谢的酶ꎬ参与苯丙 烷代谢的首步反应ꎬ是苯丙烷代谢途径的关键酶和限 [４] 速酶 ꎮ ＰＡＬ除参与ＦＡ 的生物合成外ꎬ还可作为植 [５] 物抗逆性的一个生理指标 ꎮ 目前人们对苯丙烷代 谢途径的了解已逐渐深入ꎬＰＡＬ基因已在很多植物中 － [６ ７] 得到克隆 ꎬ但有关ＰＡＬ调控当归ＦＡ生物合成的 － － ＰＡＬꎬ苯丙氨酸解氨酶ꎻＣ４Ｈꎬ肉桂酸 ４ 羟化酶ꎻ － － － － 研究较少ꎮ 本研究在前期克隆得到当归ＰＡＬ 编码基 ４ＣＬꎬ４ 香豆酰 ＣｏＡ连接酶ꎻＣ３Ｈꎬ香豆酸 ３ － － 因全长ｃＤＮＡ 的基础上ꎬ构建原核表达载体ｐＧＥＸ￣