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实验三 消毒灭菌和药敏试验 第一部分 消毒灭菌 1.掌握常用的消毒与灭菌技术 2.熟悉紫外线杀菌试验的原理 3.了解细菌L型的诱导和菌落类型 擦拭法 高压蒸汽灭菌法 常用消毒灭菌的方法 物理法 化学法 浸泡法 熏蒸法 喷雾法 热力消毒法 生物 净化法 辐射消毒法 燃烧法 烤箱法 煮沸法 干热法 湿热法 日光曝晒法 紫外线灯照射法 电子灭菌灯法 电离辐射法 种类 方法 效果 用途 干 热 焚烧 用焚烧炉燃烧 灭菌 废弃污物、尸体 烧灼 火焰烧灼 灭菌 接种环，试管口 干烤 干烤箱，热空气 160~170oC×2h 电磁波热效应 灭菌 灭菌 玻璃器皿等耐高温的物品 医疗器械 湿 热 煮沸法 100oC×5~10分钟，沸水 消毒(芽胞杀不死） 饮水和食具 高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌器 103.4Kpa(15磅/吋2/1.05Kg/cm2) 121.3oC×15~20分钟 灭菌（芽胞杀死） 耐高温、耐湿物品 （基础培养基、生理盐 水、手术辅料等） 红外线 高压蒸汽灭菌法的使用：p58 加水→装锅→加盖→排气→灭菌→起锅 高压蒸汽灭菌锅使用步骤及注意事项： ①先将筒内注水，然后把要灭菌的物品装入内筒，再把盖拧 紧，打开排气阀门，开始加热。 ②水沸腾后，排气阀门开始排出气体，待筒内气体全部排出 后，关闭排气阀门。（见书表2-6） ③筒内压力维持103.4kPa，121℃，15~30min，即可达到灭 菌的目的。 ④关闭热源，自然放凉，待压力表指针下降到零时，方可开 盖取物。 ?：260~266nm（最佳杀菌波长） 杀菌原理：使DNA上相邻的T碱基通过共价键结合成 二聚体，干扰DNA复制与转录，导致细菌死亡。 特点：穿透力弱，对皮肤、眼有损伤。 适用范围：适用于空气和物体表面消毒。 紫外线（ ultraviolet ray，UV） 滤过除菌法 杀菌机理：含有微细小孔0.22μm,只允许液体或气体及孔径0.22μm的颗粒通过，细菌不能滤过。 不能除病毒、支原体 适用范围：血清、毒素、输液、生物制品、抗生素以及空气等的除菌。 第二部分 药敏试验 1.掌握药敏试验的原理、步骤、结果及 意义 常用抗菌药物敏感性试验 纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 联合药物敏感试验 特殊耐药菌及耐药酶的表型检测 耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测 β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等 1、纸片扩散法（K-B法） 原理： 含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度 方法： 菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准； 涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60o，最后沿平板内缘涂抹1周； 贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm； 孵育：35oC 16-18h，量取抑菌圈直径。 注意事项 1 纸片应分布均匀，中心距离不小于24mm。 2 含菌平板必须避免过浓或过稀。 3 纸片贴完后应在15min内将平板反过来，置于37度温箱中。 4 纸片一旦接触培养基就不应再挪动位置。 5 要注意无菌操作。 结果： 抑菌圈 大肠杆菌 金葡菌 庆大霉素 青霉素 环丙沙星 （直径mm） 结论： ？？？ 结果判读： 用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）标准判读结果； 报告：细菌对该抗生素是 敏感（susceptible，S）； 耐药（resistant，R）； 还是中介（intermediate，I）。 * 六、如何理解MIC值及药敏结果？ 每种药物均提供定性和定量两种结果。 定性：敏感（S）表示该药物对该细菌有抑制或杀灭作用。使用常规剂 量可以达到有效的治疗效果。 中介（中度敏感，I）表示细菌对该药物治疗的敏感性低于敏感 菌株，必须加大剂量以达到更高的血药浓度才能在特定的生理部 位获得有效的临床效力；对于使用剂量有严格限制的药物则必须 重复测试