利用DNA改组技术产生λ噬菌体CI温敏阻遏蛋白-遗传学专业论文.docx

浙江大学硕士学位论文摘要 浙江大学硕士学位论文 摘要 ^噬菌体cI阻遏蛋白在控镥0噬菌体的溶源裂解途径中扮演着重要的角色。 通过经典的遗传学方法，已经分离得到几个温敏阻遇蛋白，其中包含有最有名的 cIts857温敏阻遏蛋白。在基因工程中，由^噬菌体PL、PR强启动子和温敏蛋白 clts857构成的表达系统常用来调控外源基因的表达。把培养温度从30℃提升到 42℃，能够使cIts857温敏蛋白失活，从而诱导外源基因的表达。研究发现大肠 杆菌在温度上升到40℃以后，由于热击产生的蛋白水解酶会显著地加快外源蛋 白的分解。丽低于40℃时，湿敏表达系统调节外源基因的表达效率较低。大肠 杆菌的正常生理条件是37℃，我们希望获得在此温度下就具有良好温敏特性的 阻遏蛋白。DNA改组技术是一项有效的体外突变重组技术，该技术在对序列相 关的基因发生重组的网对，也可引入～定数量的点突交。本实验首次应用DNA 改组技术，对野生型cI阻遇蛋白进行体外分子进化，获得了在37℃下温敏诱导 效果比cIts857好的5个突变体。实验内容与结果如下： i．功能性克隆d基因和c酗857基因 以野生型^噬菌体和温敏突变体^dts857基因组为模板，用PcR扩增cI和 cIts857基因。酶切后插入含有砌z作为报告基因的原核表达载体DYPx4062 ((泐balll(No：Ayl 7845 1)。通过观察克隆颜色的交化和DNA澳#序验证，构建了 含有cI和cns857基因活性表达的质粒pⅥ’x4062．cI和pYPx4062-cIts857。 2．利用DNA改组技术获得突变的cI基因 从质粒pYPx4062一cI中用PcR扩增获得d基因，优化DNA改组程序，获 得突变的d基因，酶切后插入到表达载体pYPX4062。 3．突变质粒库的构建和筛选 采用电击转化法将连接物转入大肠杆菌胁呓缺陷型菌株构建突变质粒文库， 库容为1．04×106。通过筛选，获得132个具有温敏表型的克隆。与cIts857比较 后，选出5个表型最显著的克隆，编号为cIts6，dt914，cns81，cIts85以及cItsl07， 口一半乳糖苷酶莰i活结果显示，这些克隆在37℃下的诱导效果分别为cIts857的 1 38，3 77，5 12，3．35和1．61倍。 4 DNA序列的测定和分析 浙江大学硕士学位论文对上述5个克隆进行了DNA序列测定，结果表明cns6有3处核苷酸发生 浙江大学硕士学位论文 对上述5个克隆进行了DNA序列测定，结果表明cns6有3处核苷酸发生 突变，分别为A77GG眨59c，T506c；cItsl4有两处发生突变，分别为A199G， A602G；cns81有4处发生突变，分别为A44G，G92A，GB79A，A629T；clts85 只有一处突变为c188T。cItsl07有3处发生突变，为G160A，A488G，T56lC。 13个突变中只有一个为同义突变，没有引起相应的氨基酸改变。得到的每一个 克隆均有突变发生在阻遏蛋白的N端，其中199位上的突变与cIts857的突变相 同，188位上的突变与另一温敏突变株cItsu46一致，但氨基酸不同。 关键词：DNA改组技术；cI胆遏蛋自；湿敏殂遏蛋白；突变 2 浙江大学硕士学位论文AbstIact 浙江大学硕士学位论文 AbstIact CI repfessor protein pIays a key r0Ie in controlling the丸phage infection行om lysogen to lysis．Scveral thefmo·labile CI Vari跏ts had been isolated，among which the most famous was CIts857．In genetic engineering，the design of expression vectors based on the strong PL(0r PR)Lambda phage and CIts857 was abIe to con仃0Ithe expression of a cloned gene．既矗P一幽胁∞疗recombinam cultures caffying such Vectors are usually induced by a temperature shift from 30℃to 42℃．It is known that the rate of protein degradation in EcD矗cells above 40℃ is significantIy increased because the eXpression of protease is induced by hea