第十四章基因工程及常用分子生物学技.ppt

（二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）目的基因(target gene) 定义： 指基因工程研究中，感兴趣的基因或DNA。 例如： 1. 化学合成法 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(PCR) （一）PCR 的故事 末代沙皇尼古拉II 1918年的流行性感冒病毒 电影《侏罗纪公园》 辛普森杀妻案 上述四件事情到底有什么相关呢？ PCR最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。 PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 多利诞生过程 第一例基因治疗－腺苷脫氨酶缺乏症 基因治疗过程： ADA基因+ 载体（逆转录病毒） 重组DNA分子 导入 患者淋巴细胞生长分裂 10天 ADA基因表达 回输患儿体内 1~2月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25% 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 （一）分子杂交与印迹技术的原理 复性 RNA DNA 1、印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 2、探针技术 NC膜 DNA或RNA 探针 （二）印迹技术的类别及应用 1、DNA印迹 (Southern Blotting) 2、RNA印迹 (Northern Blotting) 3、蛋白质的印迹 (Western Blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 用于RNA的定性定量分析。 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 分子杂交实验 ① ② ③ 二、聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 然而近二十几年来生物技术的一项新发明，把它们给连在一块了。这项技术就是“聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR） 答案是NO! Kary Banks Mullis the Pacific Coast Highway PCR的点子，据穆里斯的说法，那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。 变性 95 ?C 延伸 72 ?C 退火 Tm-5 ?C 1. PCR的基本反应步骤 （二）PCR技术的工作原理及应用 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 2.PCR体系基本组成成分 黄石公园的热泉 1973年台湾科学家钱嘉韵从黄石公园热泉里一种嗜热菌中成功分离出耐高温的Taq DNA聚合酶。 Thermus aquaticus 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 3. PCR技术的工作原理 5? 5? 5? 5? 5? 5