磷脂酰丝氨酸的提取及其对大鼠海马神经元的抗氧化研究-食品科学与工程专业论文.docxVIP

山东师范大学硕!L学位论文摘 山东师范大学硕!L学位论文 摘 要 近年来，随着人口老龄化的加速，衰老和脑退化引起的一系列疾病己普遍存在 且严重影响老年人的生活能力。对衰老这一重大课题的了解目前仍仅限于一些初步 实验和学说，其中以氧自由基和细胞凋亡学说影响最大，衰老的自由基学说认为氧 自由基导致的细胞凋亡是影响衰老进程的重要原因，但详细的损伤机制还有待探 讨。 海马是学习记忆的关键部位，并且对衰老极为敏感，氧自由基对海马神经元的 损伤是导致记忆下降的重要原因：乙酸佛波酯(PMA)是一种肿瘤诱导剂，可以刺 激细胞产生活性氧(ROs)自由基，常用来诱导细胞凋亡，但迄今为止并没有诱导 海马神经元凋亡的报道；大量研究表明磷脂酰丝氨酸(PS)在提高学习记忆，改善 脑功能，维持和修复神经细胞等方面具有重要作用，但前人主要研究了PS在体内 环境中的生理功能，采用的都是口服PS的方式，并未进行细胞水平的研究。 因此本论文以牛脑为原料提取PS，采用PMA诱导大鼠海马神经细胞凋亡，首 次在细胞水平上进行了PS对海马神经元的抗氧化抗凋亡研究。 目的：研究不同浓度的磷脂酰丝氨酸(Ps)对原代培养的大鼠海马神经元的抗 氧化作用，并对自己提取和Sigma公司两种来源的PS的抗氧化作用进行了比较。 方法：从新鲜牛脑中提取PS，并采用薄层层析和薄层扫描的方法对其进行了定 性和定量。原代培养大鼠乳鼠海马神经元并用不同浓度PMA处理不同时间刺激细 胞产生活性氧(ROS)诱导细胞凋亡。应用吖啶橙染色激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope，LSCM)检测细胞旖亡率，倒置荧光相差显微镜检测不 同凋亡时期的细胞形态。磷脂酰丝氨酸外翻实验分析细胞的早、中及晚期凋亡。通 过萘荧光探针实验(NFDS—I)检测受刺激后细胞内H202的量来验证PS对海马神 经元的保护作用。 结果：PS提取方法简单，提取率高，薄层层析分离效果好，样品回收率高。 PMA诱导细胞凋亡结果显示适宜采用1029／L PMA诱导神经元24h建立强亡模型。 吖啶橙染色结果显示两种来源的PS在1．5和15mg／L浓度下均有明显的抗凋亡作用， 与致凋亡组比较，差异均极显著，但15mg／L的抗凋亡效果更好；而150me；，LPS未 发现对细胞有明显保护作用；同浓度下自提的Ps比Sigma公司的抑制细胞凋亡情 况稍好。倒置相差显微镜结果也证明15mg／L PS能有效抑制PMA引起的神经元凋 4 山东师范大学硕士学位论文亡．萘荧光探针实验表明空白对照组细胞探针孵育后未产生荧光现象，10。29，LPMA 山东师范大学硕士学位论文 亡．萘荧光探针实验表明空白对照组细胞探针孵育后未产生荧光现象，10。29，LPMA 损伤细胞24h后加入探针显示强烈的荧光，而PMA损伤前15mg／L PS预保护组荧 光强于空白对照组，但明显比PMA损伤后的弱。Annexin V．FITC+PI双染实验能清 楚的检测细胞的早晚期凋亡。 结论； 1)一定浓度的PMA可以刺激大鼠海马神经元产生ROS自由基，损伤神经细胞， 本实验采用PMA刺激建立海马神经元的凋亡模型是稳定可靠的。 2)适当浓度的PS可以增强海马神经元的抗氧化能力，说明，PS在细胞水平上可以 起到保护神经细胞的作用，进一步肯定了PS具有促进学习、增强记忆和改善老年 性疾病的作用。 3)过高浓度的PS对细胞有一定的毒性。 4)自己提取的PS比Sigma公司的PS抗神经元氧化作用更明显，证明实验提取分 离的PS方法可行可靠。 刨新性： 1)提供了一套切实可行的分离动物脑磷脂的薄层层析参数． 2)第一次采用PMA诱导海马神经元的凋亡并取得了最适宜的药物浓度和时间。 j)首次在细胞水平上进行了Ps对海马神经元的抗氧化和抗凋亡研究，并取得了理 想的实验结果，为有效的治疗和预防衰老和脑相关疾病提供了一种有效的药物。 关键词：大鼠，海马，神经元，乙酸佛波酯，凋亡，磷脂酰丝氨酸，保护 山东师范大学硕士学位论文Abstract 山东师范大学硕士学位论文 Abstract In recent years，along with the accelerated aging of the population,aging and degeneration of the brain has become widespread and serioI塔diseases affecting the elderly ability of fivmg．The major topic of aging research is still limited to some preliminary experiments and theories，ofwhich ox