硫酯酶结构域和酮内酯类化合物生物合成之间关系的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要硫酯酶结构域和酮内酯类化合物生物合成 摘要 硫酯酶结构域和酮内酯类化合物生物合成 之间关系的研究 摘要 ，， 红霉素(erythromycin)C．3位羟基由模块6中酮还原酶(keto reductase，KR) 决定，因此，通过基因工程的方法敲除或使KR6丧失功能后，c．3位可保持酮 基状态。利用染色体同源重组技术已构建了一系列糖多孢红霉菌KR6突变体， 均合成酮内酯类化合物3．脱氧-3．羰基．6．脱氧．红霉内酯B (3-deoxy-3-OXO一6一deoxy．erythronolide B，DODEB)，并进一步被羟基化修饰为 3．脱氧．3．羰基．红霉内酯B(3-deoxy-3．oxo-erythronolide B，DOEB)，然而产量 比较低。 在聚酮合成酶(polyketide synthase，PKS)中，硫酯酶(thioesterase，TE) 负责将聚酮长链从PKS上水解下来，并在其它酶域的协助下环化为大环内酯环， 因此对聚酮的生物合成非常重要。DODEB的环化|ji『体B．长链酮脂肪酸不是红霉 素TE(EryTE)的天然底物，E叮TE对它的催化效率可能会降低。为研究TE酶 结构域与酮内酯类化合物合成之间的关系，克隆了EryTE的基因，分别连接到 表达载体pZM和pZMW上构建表达质粒。PEG介导原生质体转化法将表达质 粒转入糖多孢红霉菌KR6突变体中表达。以乙酸乙酯萃取发酵产物，通过薄层 层析和枯草杆菌抑菌试验进行产物及活性检测。结果显示EryTE并没有显著促 进酮内酯类化合物DODEB的合成。研究指出，载体蛋白(aeylcarrierprotein， ^ AcP)与TE结合在一起更能有效发挥TE酶结构域的催化活性，因此，又克隆 _—-t j 了红霉素ACP6-TE(EryACP6-TE)的基因并转入KR6突变体表达，仍旧没有显 著促进DODEB的合成。 C-3位的酮基是影响EryTE活性的最大可能部位，苦霉素(pikromyein)TE 催化c．3位为酮基的聚酮链底物的能力远比EryTE为高。为此，克隆了苦霉素 硫酯酶结构域和酮内酯类化合物合成之间芙系的研究 硫酯酶结构域和酮内酯类化合物合成之间芙系的研究 ACP—TE(PikACP-TE)的基因并转入KR6突变体中表达，结果也没有检测到 DODEB合成产量的显著提高。这揭示了，结构域独立于聚酮合成酶模块 (module，M)时，不能自效发挥功能，将TE酶纪构域融合=卜模块中或许口，以 有效发挥活性。基于上述原因，利用染色体同源重组技术，以苦霉素模块6中 PikACP．TE的基因直接替换糖多孢红霉菌染色体模块6中EryKR6．ACP6．TE的 基因构建了TE酶结构域替换菌株A226．PTE。然而，质谱分析A226．PTE的发 酵叔时并没自枪测到DODEB及其修饰物的特征峰。推测杂合摸块中结构域蚓i：}{ 别效率降低进而造成杂合模块活性的下降，是没有检测到酮内酯类化合物的原 因之一。 模块是聚酮链合成的最小功能单位，因此，模块替换可能更为合理。不过， 考虑到整个模块6的替换难度太大，因此，先将苦霉素模块6(PikM6)的基因 转入KR6突变体中表达。结果显示PikM6显著促进酮内酯类化合物的合成。表 明，以独立肽链形式存在的PikM6在糖多孢红霉菌中可以充分发挥聚酮合成酶 的功能，这为下一步的模块替换提供了现实依据；同时也证实了，TE只有融合 于模块中，在模块中其它所有结构域协助下，才可以充分发挥硫酯酶的功能。 此外，向突变体中导入苦霉素模块6，可以合成具有生物活性的抗生素物质，表 明糖多孢红霉菌的糖基化酶对酮内酯类化合物仍然具有部分糖基化修饰作用。 关键词硫酯酶；酮内酯类；糖多孢红霉菌；苦霉素；模块 ^ 。』 n AbsttactStudy Absttact Study on Relation ship Between Thioesterase Domain and Ketolide Biosynthesis Abstract Since the formation of C一3 ketone group of macrolactone ring depended on the ketoreduetase fKR)domain of the sixth module of polyketide synthase that catalyzed the synthesis of 6-deoxy·erythronolide B，we could make KR6 domain inactivated or deleted by genetic engineering for ketolide biosynthesis．Since 2002，sev