利用双右边界（DRB）双元载体系统和MAS技术改良水稻白叶枯病抗性的分析-果树学专业论文.docxVIP

论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四jl{农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：鲁易爿务碉 胤／7日 } 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名 ．鞘诵 芷 占月≯7日 } 导师签名：帚蝴 J椰r年／月净日 ／ 摘要水稻是一种重要的粮食作物，白叶枯病(Xanthomonas 摘要 水稻是一种重要的粮食作物，白叶枯病(Xanthomonas oryzaepv．oryzae,Xoo．)是 水稻的主要病害之一，控制这种病害最经济有效的方法是将白叶枯病抗性基因导入其 栽培品种。目前最常用的外源基因导入方法是根癌农杆菌介导的遗传转化和分子标记 辅助选择技术(Molecularmarker．assisted seleetion，M_AS)。Xa21基因是从水稻中分 离并克隆的第一个抗病基因，对白叶枯病具有广谱抗性。Xa23基因是章琦等从我国 普通野生稻中鉴定发掘出来的显性抗白叶枯病基因，对国内外所有鉴别菌系都表现为 高抗，全生育期抗病。 目前农杆菌介导的籼稻转化体系并不完善，本研究对蜀恢527、绵恢725、创恢 11、培矮64S、D62B和9311等6个籼稻品种的幼胚和成熟胚愈伤组织的诱导与再生 条件进行了研究，其结果显示，MS培养基比CC培养基更适合籼稻幼胚和成熟胚愈 伤组织的诱导。但CC培养基比MS培养基更适合成熟胚愈伤组织的继代培养，在 CC培养基上繁殖的愈伤组织不易褐化，且胚性更好；MS培养基比CC培养基更适合 用于幼胚和成熟胚愈伤组织的筛选与抗性愈伤组织的分化；判稻出愈率与甘露醇的浓 度密切相关，随着甘露醇浓度的降低而增加；幼胚诱导获得的愈伤组织颜色、质地 和对潮霉素(Hyg)耐受性都优于成熟胚获得的愈伤组织，生长速度和分化出苗率都 高于成熟胚获得的愈伤组织。但是，幼胚受取材时间的限制，不能获得大批量的愈伤 组织。 籼稻对Hyg的敏感性试验发现，不同基因型对Hyg的敏感性不同，而且同一品 种在不同培养基上对nyg的抗性也不同，几乎所有的品种在MS筛选培养基上的对 Hyg的抗性比在CC筛选培养基上的抗性低。籼稻在分化过程中，对rIyg最为敏感， 只要在分化培养基上添加20meCL的Hyg就足以将转化细胞与非转化细胞区分开，在 壮苗生根培养阶段。15mg／L的Hyg浓度是合适的筛选浓度。 共培养过程中细菌的状态和浓度对转化效率的影响很大。如果菌液浓度过高，菌 体本身易相互聚结，从而影响其在外植体上的附着：浓度过低时，不利于基因的转入。 本试验研究结果表明，共培养所用农杆菌苗液的OD600=0．2左右为宜，在这种浓度下， 使用250mg／L Cb+250rag／L cef可以完全有效地控制农杆菌。 利用双右边界(double fight--border，DRB)的双元载体(z,pt标记基因位于两 个右边界之间，Xa21基因位于相邻的两个左右边界之间)转化水稻C418、明恢86、 个右边界之间，Xa21基因位于相邻的两个左右边界之间)转化水稻C418、明恢86、 绵恢725、创恢1t、培矮64S、D62B和9311共7个栽培品种，已获得无选择标记基 因转Xa21基因的C418To植株27株，明恢86和D62B转基因植株3株和11株。 田间抗性鉴定结果显示，检测的C418 To代27株转基因植株中有17株C418 To 转基因植株抗白叶枯病，9株感病；7株D62B和3株明恢86高抗白叶枯病。通过 PCR检测，所有17株抗白叶枯病的植株都能扩增出Xa21基因的特异性条带，而感 病的植株则没能扩增出Xa21基因的特异性条带。11株D62B中有7株PCR扩增Xa21 基因呈现阳性，3株明恢86PCR扩增Xa21基因呈现阳性。通过转基因后代自交分离， 有5株C418植株得到无标记基因的后代，无标记基因转基因植株占总转基因植株的 9．5％。在T2代，C418的无标记基因只含Xa21基因的纯合系。在T3代进行田间抗性 鉴定发现，所有的转基因植株都表现明显的抗白叶枯病，没有抗感分离。通过PCR 分析发现．所有转基