硫酸软骨素化学发光法的快速测定及其ELISA双抗体夹心法的建立-卫生毒理学专业论文.docxVIP

郑州大学2007届硕生学位论文 郑州大学2007届硕生学位论文 中文摘要 硫酸粘多糖的正确命名是糖胺多糖(glyeosaminoglycan，GAG)，它是由糖 醛酸与乙酰氨基糖或其硫酸酯组成的二糖单位形成的重复序列。哺乳动物的 GAG包括硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，cs)、硫酸皮肤素(Dermatan sulfate， DS)、硫酸角质素(Karatansulfate，KS)、肝素(Haparin，HP)、硫酸肝素或硫 酸乙酰肝素(Haparan，HS)及透明质酸(Hyaluronieacid，HA)6种。研究发现， 硫酸粘多糖在肺癌早期即有丹高，无论原发还是转移性肺癌，癌组织中均有GAG 含量增高，主要以透明质酸(HA)和硫酸软骨素(CS)的升高为主。 目前国内外相关报道的检测硫酸软骨素的方法很多，如比色法、色谱法、 电泳法、配位滴定法、原子吸收法等。但这些方法都有其自身的局限性，主要 是灵敏度低，本课题希望建立一种快速、灵敏、准确的检测硫酸软骨索的方法， 为下一步建立检测硫酸粘多糖的方法奠定基础。 方法和结果： 1．采用ce4+_Na2S03-H2s04氧化还原体系，并利用该体系中加入硫酸软骨素 后发光强度明显增强的特点，建立了一种快速测定硫酸软骨素的化学发光分析方 法。检测结果如下：回归方程为y=0．4219x+3．3532，r=O．9968(其中Y为样品RLU 与空白RUJ的差值，x为CS浓度)，线性范围为1．0mg／L一8．0mg／L，检出限为0．5 mg／L。本部分初步建立了硫酸软骨素的化学发光检测方法，为以后的研究奠定 基础。 2．为了制备多克隆抗体，用硫酸软骨素作为免疫原分别免疫了4只BALB／cdx 鼠和2只日本大耳白兔。制备的抗血清分别用间接EusA测效价和特异性，结果 如下：4只BALI}／c小鼠抗血清终点效价分别为：1：6400，l：12800，1：6400，l：3200， 特异性良好；2只日本大耳白兔抗血清终点效价分别为l：64000，l：128000，且特 异性良好。 3。通过优化条件，初步建立了硫酸软骨素的异种动物双抗体夹心ELISA检测 方法。选取的检测优化条件为：包被抗体是1：200的2号鼠抗血清，封闭液是1％ 酪蛋白，第二抗体是1：20000的2号兔抗血清，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG(HRP-IgG)浓度是1：4000。检测结果如下：回归方程为y=0．2945x+0．3968，， =0．9819(其中y为阳性孔OD值和阴性孔OD值之差，X为ln[CS])，线性范围 是2～800 mg几，且该方法的特异性良好。高、中、低3个浓度的批内和批间相 II 郑州大学2007届硕士学位论文 郑州大学2007届硕士学位论文 中文摘要 对标准偏差的平均值分别为4．48％和5．97％。 4用间苯三酚分光光度法检测硫酸软骨素标准品，结果如下：回归方程为Y =O．0011)㈨．0106，(v是吸光度，X是cs的浓度)，相关系数，=0．9918，线性范 围为200～800 mrdL。以问苯三酚分光光度法为标准参比方法验证异种动物双抗 体夹心ELISA方法的可靠性，检测结果进行相关性和配对t检验分析，f=0．247， P0．05，r=o．999，P0．01，表明2种方法相关性良好，ELISA检测结果可靠。 结论： 1．建立了快速测定硫酸软骨索的化学发光法，回归方程为2／=0．4219x+3．3532， r=O．9968(其中y为样品RLU与空白RLU的差值，x为cs浓度)，线性范围为： 1．0 m∥n8．0 mrdL，方法的检出限为0．5 mrdL。 2．初步建立了硫酸软骨素的异种动物双抗体夹心ELISA检测方法，回归方程为 y=0．2945x+0．3968，，=O．9819(其中Y为阳性孑L OD值和阴性孔OD值之差?x 为1n[CS])，线性范围是2mg／L～800mg／L，且方法的特异性良好，检测结果可靠。 关键词：硫酸软骨素；多克隆抗体：间苯三酚分光光度法；ELISA III 郑州大学2007届硕士学位论文 郑州大学2007届硕士学位论文