灵芝孢子粉及灵孢多糖对多巴胺能神经元保护作用的实验研究-神经病学专业论文.docxVIP

旯芝弛子粉及灵弛多特对多巴胺能神经／‘保护作用的实验可f究 旯芝弛子粉及灵弛多特对多巴胺能神经／‘保护作用的实验可f究 中Lh大学硕：卜学位论义 polysaccharides GLPS)对于Hypoxj“Reoxygenacion引起的大脑皮层神经元 损伤具有神经保护作用。因此值得深入研究灵芝孢子治疗PD的可行性和 作用机理，为进一步开发、应用灵芝孢子的有效成份提供线索和依据。 研究目的 1．探讨灵芝孢子粉对LPS所致的PD大鼠模型的保护作用 2．研究灵孢多糖对LPS诱导的原代多巴胺能神经元变性的保护作用及相 关机制。 3．研究灵孢多糖对MPP+损伤PCI2细胞的保护作用。 方法和结果 第一部分在体研究灵芝孢子粉对LPS所致PD大鼠的保护作用 方法 1．LPS诱导PD动物模型的制作 2．动物分组 对照组：脑立体定向手术右侧黑质注射PBS。 LPS模型组：脑立体定向手术向右侧注射2099 LPS(LPS浓度为 5mg／m1)。 LPS+灵芝孢予粉组：先用灵芝孢子粉灌胃3天，屯体定向注射LPS， 继续灌胃14天，直至处死。 3．动物行为学观察 4．TH、OX一42、TNF一Ⅱ及iNOS染色结果观察 5．RT-PCR检测TH、TNF—d及iNOS mRNA的表达量 结果 1．动物行为学观察 正常对照组未出现旋转行为。LPS组30min旋转次数为025±12)r,LPS II 灵芝孢子粉及灵他多糖对多巴胺能神经元保护作用的实验研究 灵芝孢子粉及灵他多糖对多巴胺能神经元保护作用的实验研究 中山大学硕士学位论文 +灵芝孢子粉组30min旋转次数为(94±3)r，两组比较差别有显著性意义 0O．01)a 2．免疫组化法检测灵芝孢子粉对TH表达的影响 各组均检测到TH的阳性细胞表达，正常对照组存活的TH阳性细胞 效最多，LPS+灵芝孢子粉组有所减少，LPS组存活的TH阳性细胞数量 较前两组均减少，两处理组阳性细胞差异有统计学意义(P(O．01)。 3．OX．42染色结果 正常对照组Mic呈现典型的“分枝样”，LPS注入黑质14d后大部分 Mic活化，胞体增大，突起变短，增粗，细胞数量明显增多。灵芝孢子粉 +LPS组中的Mic数目较单纯LPS组明显减少，视野中有“分枝样”Mic。 4．免疫组化检测PD大鼠黑质TNF．Gt及iNOS的表达 正常对照组可见少量TNF．Ⅱ和iNOS阳性细胞的表达，LPS处理后的 两组可见TNF—o【及iNOS阳性细胞表达均明显增多，组间比较可见单纯LPS 组的n忭一＆及iNOS阳性细胞增多程度高于灵芝孢子粉+LPS组(PO．01)。 5．RT-PCR检测PD大鼠术侧中脑TH、TNF—n和iNOS mRNA表达 在正常对照组中有较多量的TH mRNA表达，TNF．o【及iNOS mRNA 有少量表达，LPS处理后的两组可见TH mRNA表达减少，而TNF一8和 iNOS mRNA的表达量则明显升高，在LPS+灵芝孢子组中其TH nlRNA 表达量较LPS组的表达量增多，TNF．d和iNOS mRNA的表达低于LPS 组，各组间比较有显著性差异p0。0 1) 第二部分体外研究灵孢多糖对DA能神经元的保护作用及 相关机制 方法 1．LPS诱导DA能神经元损伤细胞模型的建立 在乳鼠原代中脑神经元和神经胶质细胞共培养基础上，待细胞生长6 至7天后，选取每孔密度大约是6×105个的细胞，随机分为6组，换用 llI 灵芝孢子粉及灵于c!f多糖对多巴胜能神经元保护作用的实验研究 灵芝孢子粉及灵于c!f多糖对多巴胜能神经元保护作用的实验研究 中山大学硕士学位论文 新鲜培养基，每孔培养液为2mL，同时加入不同干预因素，每组样本至少 为5个，作用时间为24小时。 正常对照组：DMEM细胞培养液培养。 单纯GLPS组：不加LPS，而加入GLPS，终浓度为300 gg／mL。 LPS组：加入LPS使其终浓度为20 ng／mL。 GLPS预处理组3组：在加入终浓度20 ng／mL的LPS之前30min加 入GLPS，终浓度分别为50，100，300 99／mL。 2．免疫组化检测TH、OX一42、TNF．q和iNOS阳性细胞的表达。 3．RT-PCR检测TH、TNF—n及iNOS mRNA的表达含量。 结果 1．免疫组化检测GLPS对TH细胞及小胶质细胞激活和数量的影响。 在正常未予干预的共培养体系中具有较多的TH阳性细胞的表达，LPS 处理后，TH阳性细胞数明显减少，但在LPS+GLPS 1 00 gg／mL及LPS+ GLPS 300 99／mL组中，TH阳’|生细胞数量较单纯LPS组明显增多，对照组 Mic体积较小，为分枝状，数量也较LPS组减少，在GLPS 300 la9／mL组 中，未发现激活的小胶质细胞，M