利用侵染性cDNA研究甜菜坏死黄脉病毒RNA5与病毒致病性的关系-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要利用RT-PCR对来自新疆、黑龙江、宁夏、甘肃、河』b省甜菜从根病痫田的并BNYVV分离 摘要 利用RT-PCR对来自新疆、黑龙江、宁夏、甘肃、河』b省甜菜从根病痫田的并BNYVV分离 物中RNA5纽分进行检测．在来自于新疆、1}复和黑龙江的分离物中发现有RNA5的存在，说明 在我国发生的BNYVV分离物中广泛存在RNA5组分。对新疆、’j‘爱和黑龙江分离物中的RNA5 进行克隆和序列分析斤，与已报道的BNYVV日本D5分离物、法国的F72分离物以及我国内蒙 古发现的包头分离物和呼和浩特分离物的RNA5的核营酸序列和推导氨基酸序列进行同源性比 较。结果表明，不同分离物RNA5核苷酸序列的同源性为93．0％～98．7％，变异主要集中在编码 蛋白启始密码子AUG前100个核营酸的区域内。所有RNA5基因组都只包含一个开放阅读框架 (ORF)，除法国的F72(编码232个氨基酸)外，其它6个分离物都编码228个氨基酸的多肽。 各分离物的氦基酸序列同源性为89．7％～98．7％。 构建了RNA5编码蛋自的原核表达载体pETHu26，经IPTG诱导后在大肠杆菌中得到表达， 表达的融合蛋白包含载体编码的45个氨基酸和RNA5编码的26kDa蛋白。用融合蛋白免疫家兔． 制备了RNA5编码蛋白的特异性抗血清，Western blot分析表明该血清可以用于BNYVV接种番 杏叶片后RNA5编码26kDa蛋白的检测。 分别构建了T7启动子和35S启动子控制F的全跃RNA5侵染性cDNA兜隆，Northern blot 检测表明它们都具有侵染性。利用T7控制F的全长RNA5侵染性cDNA克隆pUCHu3的体外转 录物与不含RNA5的BNYVV突变株，BNYVV-Hu0和BNYVV-Hu3的RNAs混合接种番杏和甜 菜，结果表明RNA5影响病毒侵染后寄主的症状表达和病毒在寄主内的积累，并EL和甜菜丛根病 的发病程度及甜菜产量有关。这些结果表明除了RNA3外，RNA5是另外～个与BNYVV致病性 相关的因素。 在全长RNA5侵染性克隆pUCHu3的基础上构建了4个RNA5编码区缺失突变体和1个点突 变体的侵染性克隆。经体外转录后与BNYVV-I-Iu3的RNAs混合接种番杏，Northern blot检测表 明这些突变体的体外转录物都具有侵染性。崩编码区翻译起始密码(AUG)突变体侵染性克隆 pUCHu3△ATG体外转录物接种番杏叶片，经对发病植物的检测，1晓明RNA5编码蚩自的表达与 否不影响BNYVV在番杏上的症状表现，即RNA5对于BNYVV致病力的影响可能是在核酸水平 上的作刚。这些突变体对RNA5的功能的影响正在进一步研究中。 关键词：甜菜坏死黄脉病毒，RNA5，侵染性eDNA克隆，致病性 AbstractBNYVV Abstract BNYVV isolates from Ningxia，Xinjiang，Hei／ongjiang，Gansu and Hebei provinces were screened by RT-PCR and the RNA5 component was identified in the isolates from Ningxia．Xinjtang and Heilongjiang among them，indicating that the BNYVV isolates containing RNA5 component were widely distributed in sugarbeet growing areas of China The RNA5 components were cloned into pUCm—T vector and transformed ln￡coE strain DH一5 d．Sequence analysis showed that the RNA5 components in the isolates from Ningxia，Xinjiang and Heilongjiang have 1347nts，l 348nts，1346nts respectively．Comparing with the RNA5s in D5，F72，Bao and Hu isolates reported previously,identities shared between them were varied from 93 0％～98 7％in nucleotide sequences and 89 7％～98．7％in deduced amino acid sequences． The bacterial expression vector of pET-Hu