酪蛋白调控序列指导下的人乳铁蛋白基因在动物乳腺中表达特性的研究-兽医临床专业论文.docxVIP

耿士患：酪蛋白调控序列指导下的人乳腺铁白基因在动物乳腺中表达特性的研究 耿士患：酪蛋白调控序列指导下的人乳腺铁白基因在动物乳腺中表达特性的研究 第一部分概述 论文中文摘要 本研究是利用牛和羊的酪蛋白的基因组调控序列和人孚L铁蛋白cDNA组成 融合基因，应用转基因技术制作乳腺特异性表达人乳铁蛋白的转基因山羊．。 从正常妇女乳腺细胞cDNA库中，利用高保真Taq酶PCR法扩增出我们所 需要的人乳铁蛋臼cDNA基因的两个不同大小的片段(2．18Kb，2．32Kb)。经克 隆和测序，证明DNA序列是正确的，然后以PGEX4T-3为载体进行部分片段原 核表达，所产生的融合蛋白中与人乳铁蛋白部分具有相同的抗原性。再用PCR方 法从牛基因组DNA中扩增出牛。扩酪蛋自基因的5锶控区(2．3Kb)和37调控区 (1．5Kb)以PGEM质粒为载体拼接成的调控序列匙然后在调控序列A的基础 上，在5／端上游又增加了长约为4Kb牛酪蛋白基因的基因组DNA调控序列，形 成调控序列B。以及构建好的山羊13．酪蛋白基因的调控序列C。得到的三个调控 序列(A、B、C)与人乳铁蛋白基因eDNA的两个片段(2，18Kb，2．32Kb)构 建成六个融合基因构件(PCNl，PCN2，261，AF203，PL238，PF84)。此六个 基因构件分别在泌乳之前10天左右导入母山羊的乳腺组织中进行暂态表达。结 果出现了不同的表达水平，其中PCN2，261，AF203较高，分别为 88ng／ml，t44ng／ml，63ng／ml，用表达量比较高的构件“261”进行制各转基因动物。 显徽注射148个受精卵，产羊羔16只，最后获得了4只整合人乳铁蛋白基因的 转基因山羊。 关键词：人乳铁蛋白 转基因 表达山羊 塑型查兰曼圭兰垡熊苎 塑型查兰曼圭兰垡熊苎 ! Abstract Study on expression ofHuman htctofcrrin eDNA in the transgenic Mammalian Gland under control of casein gene of bovine goat M．scandidate Geng Shizhong Supervisor Professor Cheng yong This paper WaS studied the expression of Human Lactoferrin eDNA in the m封mnary gland of雠黜goats by using fusion gene constructed with regulative elements of casein gene and LTF eDNA．Then the transgenic goats and mice were produced by microinjecting the fusion gene into pronuelear of fertilized eggs．The biological reactor was made from the transgenic mammary specific-expression goats． The human lactoferrin eDNA(hLlF)w鹋amplified from the templet ofhuman m删卸略巧eDNA by PCR with high fidelity Taq enzyme．After cloned and sequenced, the hLTF cDNA sequence w船proved concct，hLTF was expressed in the microorganism using PGEX 4T-3 vector．．Subsequently,we amplified 5’-regulative sequence(2．3Kb)and 3’·regulative sequence(1．5xb)of bovine asl-casein gene fiom bovine genome DNA w／th PCR,connected the regulative sequence with PGEM vector，then cloned the regulative sequence A；4Kb bovine genome DNA of 5’- upstream regulative sequence was spliced to the sequence A，regulative sequence B WaS formed；the regulative sequence C of B-casein gene had been c