利用电融合方法生产体细胞克隆小鼠-基础兽医学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 摘 要 目前，生产体细胞克隆小鼠的常规方法是注射方法，只有1篇文章报道片j尾尖成纤维细 胞与去除遗传物质的M II期卵母细胞融合，成功生产体细胞克隆小鼠，但是克隆的效率远远 没有达到人们预想的程度。 本实验主要研究电融合技术对于体细胞克隆小鼠生产的可行性和影响因素。采用新鲜的 颗粒细胞直接注入到去除遗传物质的MII期卵母细胞的透明带下，在1次2．4kvlcm，20usee 的直流电脉冲作用下，采用没有Ca2+融合液(O．3mol／L甘露醇)诱导细胞融合。融合后的胚 胎经过l小时的培养，放置在含有10mmol／L s一的激活液中活化6小时。活化后的胚胎，一 部分在体外培养3．5天，观察囊胚发育率，并且移植到假孕2．5天的代孕母鼠子宫中；另外一 部分在体外培养到2．细胞期，移植到假孕o．5天的代孕母鼠输卵管壶腹部中。19．5天后，通 过剖腹产获得体细胞克隆小鼠。对照实验采用注射的方法同样获得体细胞克隆小鼠。通过对 电融合和注射方法获得的克隆胚胎对比，发现2种克隆胚胎在活化率上没有显著差异(87．3％ VS 90．3％，PO．05)。但是在卵裂率(82．4％VS 92．9％，PO．05)和囊胚率(47．3％VS 57．2％， PO．05)上，具有显著差异。实验还对影响融合效率的一些因素进行了研究，包括受体卵母 细胞的老化，融合参数的改变、不同品系小鼠核移植、不同供体细胞核移植等影响因素对于 电融合重构胚胎体外发育的影响。实验结果证明，目前使用的融和参数与融合条件都是合理 并且可行的。 实验证明，两种核移植技术都能获得体细胞克隆小鼠。由于目前电融合技术已经成为克 隆动物生产中的常规手段，因此从技术角度而言，Lb融合技术更便于广泛推』“和使用。 关键词电融合；小鼠：核移植 东北农业大学农学硕士学位论文Alive 东北农业大学农学硕士学位论文 Alive Mice Birth After Electrofusing Cumulus Cell With Enucleated Oocyte Abstract Up to now,most of the somatic cell nuclear transfer(SCNT)mice were produced by injection method except for one by electrofusing fibroblast cells with enucleated oocytes，and the cloning procedure was still far away from the routine．The present study examined the feasibility and effectofelectrofusiontechnologytotheproduction ofSCNTmice． The fresh cumulus cells were transferred jnto the perivitelline sl：Iace of the enucleated M 1I oocytes，electrofusion was performed in the 0．3M mannitol fusion medium without Caz’．the stimulation WaS one 2．4kv／cm，20usec electrical pulse．The reconstructed embryos were cultured for 1 hour in vitro and then activated by 6 hours treatment of 1 0mM Sr2+．Some of the activated reconstructed embryos were cultured{n vitro for 3．5 days．and then transfefred into the uterus ofthe 2，5 days pseudopregnant mice，the others were cultured to the 2-cell stage in vitro，and transferred into the oviduct of 0．5 day pseudopregnant foster．At 19．5 days，the somatic cloned mice were delivered by Caesarean secession．Cloned embryos derived from injection method(Wakayama et al， Nature 1998)were used as contr01．Resul