PCR技术克隆目地基因全过程.docVIP

实用标准文案 文档大全 实验：目的基因克隆（PCR技术） 【课前预习】 PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。 【目的要求】 1．学习和掌握 PCR 反应的基本原理与实验技术方法。 2．认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。 【基本原理】 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA的变性：模板 DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板 DNA双链或经 PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 【实验用品】 1．材料：重组质粒DNA作为模板 2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的 PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机 3．试剂： ① 10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在 25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100。 ② MgCl2 ：25mmol/L。 ③ 4 种 dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。 ④ Taq DNA聚合酶 5U/μl。 ⑤ T4 DNA连接酶及连接缓冲液： 【方法步骤】 （一）PCR反应 1. 依次混匀下列试剂 35μl H2 O 5μl 10×PCR反应缓冲液 4μl 25mmol/L MgCl2 4μl 4种dNTP 0.5μl 上游引物（引物１） 0.5μl 下游引物（引物２） 0.5μl 模板DNA(约1ng) 混匀后离心5秒。 2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。 3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。 4 电泳 按前所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。 [注意] 1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 【实验结果】 【注意事项】 微量操作、PCR 反应体系的设计、引物设计、扩增条件的优化 【思考题 】 1. 降低退火温度对反应有何影响？ 2. 延长变性时间对反应有何影响？ 3. 循环次数是否越多越好？为何？ 4. PCR有哪些用途？举例说明。 附：PCR知识(供参考) （一）PCR 反应体系与反应条件 标准的 PCR 反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理 论上，只要知道任何一段模板 DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ① 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ② 引物扩增跨度： 以 200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 ③ 引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC