磷酸钙聚合物复合纳米粒基因递送系统的研究-肿瘤学专业论文.docxVIP

上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 PAGE PAGE 10 PAGE PAGE 13 到了广泛的研究[45,46]。复合物是由阳离子脂质，中性脂类和 DNA 的组成。阳离子脂质体 易于使 DNA 进入通过内体途径进入细胞质[47]，而像 PEI 阳离子聚合物，可有效地浓缩的 DNA，并且更稳定[48]。我们在模仿普通的阳离子脂质体(CL)基因转染系统的基础上，将脂 质体技术与纳米聚合物胶束技术相结合，构建新型阳离子高分子脂质体（CPL）系统，并 将其作为基因载体，探讨其基因转染效率及转染机制，争取最大限度的提高载体的基因转 染效率。其中 CPL 为采用以壳聚糖季胺盐（OQC）为主体，小分子脂质胆固醇及二油酰基 磷脂酰乙醇胺(DOPE)共组装的阳离子纳米载体系统，通过控制纳米粒的粒径、表面电位、 组成等途径来尽可能提高 CPL 的基因转染效率和生物安全性。 三、课题研究内容 在本实验中，我们首先运用多种方法制备出高分子聚合物纳米粒、阳离子高分子脂质体纳 米粒以及二者分别与磷酸钙复合后的复合纳米粒。通过用粒径分析仪、MTT 试验、体外细 胞摄取实验和凝胶阻滞实验对纳米粒的理化性质和安全性进行表征和筛选，并初步确定 DNA 与纳米粒的最佳结合质量比。通过 DNase l 保护实验和体外基因转染实验研究了复合 纳米颗粒对所携带基因的保护作用和转染活性。最后，通过考察纳米粒在不同荷瘤裸鼠中 的组织分别，评价纳米粒在体内的转染效率和组织靶向性。 第一章磷酸钙/聚合物复合纳米粒制备与表征 前言 基因治疗已经发展了几十年，大多数基因治疗的临床研究集中在病毒载体基因递送系统。 虽然病毒载体是天然的基因载体，但是这样的递送系统不易进行有效的修饰，具有免疫原 性和潜在致瘤性[49,50]。因此，安全有效的非病毒载体逐渐成为现在研究的重点[51,52,53]。 越来越多的非病毒载体被用于基因治疗，其中阳离子聚合物和脂质体得到的关注最多。这 些研究大多的重点是如何提高非病毒载体转染效率以及减少毒性。基因治疗的基本概念是 指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗 目的[54]。基因疗法应用于临床的瓶颈之一是制备有效的基因递送载体。为了实现基因治疗， 既满足了较高的转染又具有良好生物相容性的智能载体是必不可少的[55]。非病毒载体有诸 如易于合成，细胞/组织定位，低免疫反应，质粒大小不受限制等优点。但是由于其低转染 活性，提高转染效率刻不容缓。到目前为止，已制备了多种非病毒递送系统，包括钙磷酸 盐，阳离子脂质体等。 在本实验中，选用磷酸钙、高分子聚合物和阳离子脂质体通过多种方法制备新型纳米粒 ——mPEG-PLGA-PLL、mPEG-PLA、阳离子高分子脂质体（CPL）、CaP/ mPEG-PLGA-PLL、 CaP/ mPEG-PLA 和 CaP/ CPL。并对各种纳米粒进行了初步表征，通过 MTT 实验验证纳米 粒的细胞毒性，通过凝胶阻滞实验和体外细胞摄取实验对其作为基因载体进行初步筛选。 第一节 复合纳米粒的制备 1 实验材料与仪器 聚乙二醇单甲醚（mPEG），Sigma 公司； 1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐（EDC），吉尔生化（上海）有限公司； mPEG-PLA（PLA 中 LA 为左旋，PEG Mw=5000），本实验室研制； mPEG-PLGA-PLL，本实验室研制； 透析袋（截留分子量 3500），上海绿鸟科技发展有限公司； 640 pH 计，上海英格仪器有限公司； SHA-C 型水浴振荡器，巩义市英峪予华仪器厂； TL-5.0 台式离心机，上海离心机械研究所； JY92-2D 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司； RE-5299 旋转旋蒸器，巩义市予华仪器有限公司； DZF-6020 型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司； HJ-6 六头磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司； UV-VIS750 型紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司； JEM-2100F 型透射电子显微镜，日本电子公司 Zeta 电位分析仪,英国马尔文仪器公司。 NICOMP 380 型动态光散射粒度分析仪，美国 PSS 公司。 2 实验方法 2.1 高分子聚合物纳米粒的制备 mPEG-PLGA-PLL 纳米粒的制备 采用乳化蒸发法制备 mPEG-PLGA-PLL 纳米粒[56,57,58]，具体过程如下。 精确称取 5mg mPEG-PLGA-PLL，室温下溶于 200μl 二氯甲烷后，再加入 2ml 去离子双蒸 水。低频超声 400w 超声 1min，使水油两相充分混合，溶液呈乳白色。减压蒸发 2-3min， 也可