提纯淋巴细胞.PPT

双光源系统流式细胞仪 无论每秒检测数量为多少，颗粒经过检测区的速度是衡定的 流式细胞仪标本准备 染色的一般原则及方法 操 作 从组织获取淋巴细胞 将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS； 将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离； 将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。 方 法： 其他类型细胞 在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、鼠上皮细胞。 材 料 用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液； 使用35um滤网过滤，300g离心5分钟； 用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步； 用含0.15%胰酶、0.02%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS重悬， 37oC孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。 细胞培养 许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。 准备单细胞悬液 1.仪器和试剂： 0.25%r EDTA,pH 7.2 0.25% 的胰酶 10%血清的培养液 2.方法： a. PBS洗涤细胞； b. 加入0.25%有胰酶，37oC处理2~8分钟； c. 倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。 d. PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为1×106/ml 的细胞悬液。 样 本 处 理 抗体染色一般方法 外周血白细胞分析：100ul全血 血小板分析：1~5ul全血（根据样本血小板数量） 红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用） 骨髓：100ul 其他样本，计数后决定使用体积 细胞计数方法 传统手工计数：耗时、准确度差 流式细胞仪计数： BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？ partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度 反应体积 样本中加完抗体后， 1×106细胞反应体积应不小于100ul。 抗体染色 最为普通的抗体染色原则： 1×106细胞对1 ug 抗体（抗体供应商所推荐使用单位），此浓度90%处于过饱合状态 精确使用：滴定抗体，抗体对于抗原恰达到饱合浓度 流式细胞仪抗体滴定方法 孵育、溶血、固定 抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育） 溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页） 样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间 抗体标记荧光素及其他荧光染料 荧光激发及发射原理 标记抗体常用荧光素 FITC 激发光：488nm 发射光：525nm;使用面最广，价格便宜 PE 激发光488nm 发射光575nm 此荧光的激发效率最佳，故此荧光得到的信号最强 检测某些弱表达的抗原，推荐使用此荧光素 价格较FITC昂贵 PE-Cy5 TC 激发光488nm, 发射光667nm PE-Cy7 激发光488nm， 发射光767nm 为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳 与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光谱之间影响较小 APC 激发光633nm， 发射光660 核酸染料 细胞膜电位、离子、脂类探针 现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些异想不到的效果。 详细信息，见细胞探针公司网站： www.molecularP 与流式细胞仪相关的荧光术语 MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度 自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为650~1150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光更低 流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在1000MESF以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：300MESF以内 第二部分 流式细胞仪使用一般方法及技巧 上机检测 样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测 打开流式细胞仪：预热及进行质控程序 选择相应的方案或新建方案 加载或重新调节各参数 上样检测 技巧一：定位目标细胞群体 寻找细胞群：如标本为外周血，在FS/SS散点图中信号最强的为粒细胞，依次为单核、淋巴、红细胞碎片。要寻找淋巴细胞，可首先调低FS/SS电压定位粒细胞后逐步调高电压依次寻找各细胞群。 使用目