蓝白斑筛选技术的改进及其生物医学应用-药理学专业论文.docxVIP

I I 蓝白斑筛选技术的改进及其生物医学应用 中文摘要 中文摘要 目 的 ： 探 讨 蓝 白 斑 筛 选 技 术 在 生 物 医 学 方 面 的 新 应 用 ：（ 1 ） TALENs （transcription activator-like effector nucleases）活性检测和脱靶效应评估；（2）检 测 EGFR 基因外显子 19 碱基缺失突变新方法。 方法：设计合成一系列片段长度小于 150bp 的插入片段，将插入片段与两种 T/A 克隆载体（pGEM-T Easy vector 和 pTrueBlue vector，具有不同的插入位点， 分别位于密码子 7 和另一个是密码子 11 和 36 之间）连接，进行分子克隆，进一 步观察菌落颜色并通过测序验证；人工构建基于蓝白斑筛选的含有 TALENs 靶序 列的报告质粒，进一步提出一种原核水平检测 TALENs 有效性方法的可能性；设 计一组特异性 PCR 引物，以样本 DNA（如人工构建的 EGFR 野生型、突变型质粒、 肿瘤组织 DNA、血中游离 DNA 等）为模板进行 PCR，进一步进行分子克隆。结 合蓝白斑筛选，人为改变阅读框架，致使野生型阅读框架中含有终止密码子 TAA， 缺失突变型因丢失一段核酸片段而不含有终止密码子 TAA，从而通过观察菌落的 颜色来确定样品有无 EGFR 基因外显子 19 的碱基缺失突变。 结 论 ： 基 于 两 种 不 同 插 入 位 点 的 TA 克 隆 载 体 （ pGEM-T Easy vector 和 pTrueBlue vector），若插入片段若是 3 的整数倍则菌落呈蓝色；若是 3 的非整数倍 则菌落呈白色。因此，理论上插入或缺失突变若导致 LacZ 阅读框移码则呈现菌落 蓝色变为白色的现象。成功构建 2 种含有 TALENs 靶序列的报告质粒，2 种质粒的 LacZ 阅读框分别为移码与非移码，对应菌落颜色为白色、蓝色；在此基础上提出 一种检测 TALENs 有效性的方法，即当 TALENs 特异性剪切蓝白斑筛选载体上的 靶序列时，导致多肽阅读框的非移码与移码变换，从而共转化后菌落颜色改变。 该体系还可广泛应用于锌指蛋白核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs），CRISPR-cas 系统（CRISPR–Cas systems）有效性检测。分别以人工构建的 EGFR 野生型、突 变型质粒、肺癌肿瘤组织基因组 DNA 为模板进行 PCR、分子克隆，结果显示野生 型插入片段分子克隆的菌落为白色，突变型插入片段分子克隆的菌落为蓝色。 关键词：蓝白斑筛选；TA cloning；反因子蛋白酶（TALENs）；EGFR 基因 作 者：潘韵芝 指导教师：李 凯 教授 II II 英文摘要 蓝白斑筛选技术的改进及其生物医学应用 Beta-gal Based Blue/White Screening Assay and Its Bioligical and Biomedical Applications Abstract Objective ： To investigate the bioligical and biomedical applications of beta-gal based blue/white colony screening assay: including (1) analysis of the activity and off-target effects of TALENs and (2) noninvasive diagnosis of lung cancer related EGFR deletion mutations. Methods: Two blue/white colony-based TA cloning vectors were evaluated in their color selection by inserting in-frame and frame-shifted inserts shorter than 150 bp. The Two blue/white-based TA cloning vectors（pGEM-T Easy vector and pTrueBlue vector） have different cloning sites. Colonies yielded in these assays were further confirmed by sequencing analysis. The blue/white screening method for genetic editing efficiency evaluation d