免疫组织化学教案.ppt

免疫组织化学实验技术简介 神经科学研究所：杨霄彦 免 疫 组 织 化 学 免疫组织化学（Immunohistochemistry）是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。 抗原 抗体 抗原：凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。 抗体：机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白，即抗体。 抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体。只针对一个抗原决定簇起作用的细胞群就是一个纯系，纯系的英文为Clone，音译就是克隆。 由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。 由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。 抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区之间的相互作用，是一种分子表面的特异的可逆的弱结合力。 这些弱结合力只能在极短距离内才能发生效应。因此抗原抗体结合反应的最重要的先决条件是抗原与抗体间的特定部位的空间结构必须相互吻合，具有互补性;其次，抗原决定簇与抗体超变区必须紧密接触，才能有足够的结合力，使抗原抗体分子结合在一起。 抗原抗体结合力 l. 静电引力 2.范德华引力 3.氢键结合力 4.疏水作用力 1．电荷引力（库伦引力或静电引力） 这是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力。例如，一方在赖氨酸离解层带阳离子化的氨基残基（－NH3+），另一方在天门冬氨酸电离后带有阴离子化的羧基（－COO-）时，即可产生静电引力，两者相互吸引，可促进结合。这种引力和两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷越接近，静电引力越强。反之，这种引力便很微弱。 2．范德华引力 这是原子与原子、分子与分子互相接近时发生的一种吸引力，实际上也是电荷引起的引力。由于抗原与抗体两个不同大分子外层轨道上电子之间相互作用，使得两者电子云中的偶极摆而产生吸引力，促使抗原抗体相互结合。这种引力的能量小于静电引力。 3．氢键结合力 氢键是由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。当具有亲水基团（例如－OH，－NH2及－COOH）的抗体与相对应的抗原彼此接近时，可形成氢键桥梁，使抗原与抗体相互结合。氢键结合力较范德华引力强，并更具有特异性，因为它需要有供氢体和受氢体才能实现氢键结合。 4．疏水作用 抗原抗体分子侧链上的非极性氨基酸（如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸）在水溶液中与水分子间不形成氢键。当抗原表位与抗体结合点靠近时，相互间正、负极性消失，由于静电引力形成的亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，从而促进抗原与抗体间的相互吸引而结合。这种疏水结合对于抗原抗体的结合是很重要的，提供的作用力最大。 抗原抗体反应的特点 一、特 异 性 特异性是指任何一种抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体结合而起反应的专一性能。特异性是抗原抗体反应的最重要特征之一，是由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。抗体分子N端可变区形成的槽沟，其中超变区氨基酸残基的变异性使槽形状千变万化，只有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入，其关系如锁和钥匙，因此，抗原抗体结合反应具有高度特异性。 二、可逆性 可逆是指抗原与抗体结合成复合物后，在一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，在一定条件下(如低pH、高浓度盐等)可以解离。解离后的抗原或抗体分子，仍保持原来的理化特性及生物学性状。 三、敏感性 抗原抗体反应具有高度的敏感性，不仅可以定性，而且可以定量。其敏感度因反应种类不同而异。 抗原抗体反应影响因素 影响抗原抗体反应的因素较多，主要有两方面:一方面是受到抗原、抗体的自身因素的影响;另一方面是受到电解质、酸碱度、温度及时间等实验环境因素的影响。 一、自身因素 1、抗原 抗原的理化性状、抗原决定簇的数目和种类均可影响血清学反应结果。例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集;单价抗原与抗体结合不出现可见反