桑丁香假单胞菌稳产冠菌素关键技术的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 A Thesis Submitted in Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science Study on key technology for the stable yields of coronatine of Pseudomonas syringae pv. mori Submitted by Li Gang Supervised by Professor Wu Fuan Jiangsu University of Science and Technology June, 2014 江苏科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 年 月 日 江苏科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于： (1)保密□，在年解密后适用本授权书。 (2)不保密□。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 年 月 日 年 月 日 摘要 摘要 摘 要 冠菌素是一种新型高效的生物源植物生长调节物质，喷施极低浓度的冠菌素，植 物可获得更高的抗逆性和抗病性，具有广泛的应用前景。利用丁香假单胞菌发酵是工 业化生产冠菌素有效途径之一，稳产高产冠菌素菌株是其前提。本文采用定量培养基 技术对不同微生态环境下桑丁香假单胞菌密度分布进行了研究、采用重复序列 PCR 技 术对不同生态型桑园桑丁香假单胞菌进行了分型研究和采用室温常压等离子体技术对 产冠菌素菌株进行了诱变研究。结果认为，在对桑园桑丁香假单胞菌敏感的桑品种的 桑树叶片组织中，可更有效地筛选到高产冠菌素野生菌株；利用室温常压等离子体突 变技术，可获得稳产高产冠菌素突变体。研究结果对冠菌素规模化工业发酵奠定了基 础。 1）从桑树叶片组织中能更有效地分离获得高产冠菌素野生菌株。 采用 KBC 选择性培养基对不同地区样品进行丁香假单孢菌野生菌株的筛选，对不 同微生态环境下桑丁香假单胞菌密度分布进行了检测。结果表明，桑树叶片组织和桑 园土壤中丁香假单胞菌的数量存在显著性差异，桑树叶片表现出较大的桑丁香假单胞 菌种群生长密度，这与桑疫病发生过程中丁香假单胞菌分泌冠菌素来调控植物叶片气 孔的侵染途径和方式有关。该结果为桑疫病爆发期间从桑树叶片组织中分离高产冠菌 素的野生型丁香假单胞菌株找到了事实依据。 2）水系丰富的桑园是筛选到高产冠菌素野生菌株最有潜力的目标源。 以 REP 通用引物构建重复序列 PCR 技术，对本课题组菌种库中江浙一带筛选的产 冠菌素野生菌株进行聚类分析和分型研究。结果表明，在相似系数为 0.65 时可将 29 株菌株分成 5 个类群，其中来自浙江淳安的桑树组织中假单胞菌类群的多样性程度高， 可能与该地区水源充足的气候条件有关，由此推测出野生菌株多样性与地区水分条件 可能具有一定的相关性，为后期筛选产冠菌素的桑丁香假单胞野生菌株提供了新思路。 3）常压室温等离子体诱变技术获得高产稳产冠菌素的突变体菌株。 对野生型出发菌株的冠菌素产能进行分析，发现在即使高温（32℃）下也能产冠 菌素，但产量不稳定，且产冠菌素特性退化明显。采用常压室温等离子体诱变技术对 出发菌株进行诱变，采取通用培养基培养。结果表明，冠菌素产量提高了 5%；突变株 经过 10 代传代培养后，冠菌素产量仍维持在稳定状态，变化幅度控制在 2.24%之内， 表现出工业化生产菌株的稳产特性。因此，常压室温等离子体诱变技术在保持出发菌 株高产性质前提下有效地提高了菌株产量的稳定性，为冠菌素的工业化生产菌株的高 效选育提供了一种新颖、有效的新技术。 I 江苏科技大学理学硕士学位论文 江苏科技大学理学硕士学位论文 本文首次对生态型桑园微生态系统中桑丁香假单胞菌进行定量筛选，并将常压室 温等离子体诱变技术应用于桑丁香假单胞菌的诱变，并对冠菌素产量提高机理进行了 探讨，对冠菌素高产稳产关键技术进行了研究，对于工业化高产冠菌素菌株筛选和桑 疫病监测预防具有重要的现实意义。 关键词 冠菌素；室温常压等离子体；桑丁香假单胞菌；定量筛选；重复序列 PCR II Ab Abstract A