沙门菌体内耐药诱导模型的建立与体外诱导耐药菌RNA-seq分析.pdfVIP

国家自然科学基金资助项目: 沙门菌转录激活子介导的氟喹诺酮类耐药机 理研究 项目编号 万方数据 摘要 沙门菌是一类常见的人畜共患病原菌，绝大多数对人和动物致病，可造成人和动 物的伤寒、副伤寒、败血症和食物中毒等疾病，是公共卫生的重要威胁。随着氟喹诺 酮类药物 （fluoroquinolones，FQs ）的普遍使用，沙门菌对FQs 的耐药水平不断升高， 耐药问题日益严重。目前通常使用 FQs 对敏感菌进行体外诱导来研究耐药机制，但 是体外诱导并不能确切反映沙门菌在体内时的耐药性产生机理，因为动物体内是复杂 的生物环境，机体的代谢、免疫机制等都可能会对细菌的耐药机理产生影响。本研究 以秀丽隐杆线虫N2 野生型为宿主，将鼠伤寒沙门菌 ATCC13311 定植于线虫体内， 然后使用梯度浓度递增法提高培养液中的环丙沙星浓度，诱导在线虫体内的沙门菌产 生耐药性，同时进行体外诱导耐药实验。分别扩增体内诱导和体外诱导耐药菌的gyrA 、 gyrB 、parC 和 parE 基因的氟喹诺酮耐药决定区（Quinolone resistance determining regions ，QRDR ）以及外排泵抑制子基因（acrR 、marR 、ramR 和soxR ），对PCR 扩 增产物进行测序和分析。然后分别构建鼠伤寒沙门菌ATCC13311 和体外诱导耐药株 的转录组测序文库并进行Illumina RNA-seq 双向测序，对ATCC13311 和体外诱导耐 药菌的转录组测序结果进行数据分析。最后采用荧光定量PCR 技术对转录组测序结 果进行验证。 结果表明，鼠伤寒沙门菌 ATCC13311 可以稳定定植于线虫体内，在线虫消化道 内集中分布于咽部和肠道，经过环丙沙星诱导后可产生稳定耐药菌株。经过诱导后得 到环丙沙星MIC 为4 μg/mL 的耐药菌TN4 ，体外诱导实验获到了环丙沙星MIC 为4 μg/mL 的耐药菌TW4 。TN4 的gyrA 基因发生了Asp87Asn 突变。体外诱导耐药菌TW4 的gyrA 基因发生了Ser83Phe 和Asp87Val 突变，ramR 基因出现了20bp 的缺失。 对ATCC13311 和体外诱导耐药菌TW4 进行RNA-seq 测序后获得了4.46 G 有效 数据，通过de novo 拼接，获得了311 条unigene ，平均长度为15587 bp。拼接所得到 的全序列长度为4847532 bp ，经预测4998 条基因中有4902 条得到GO 注释。采用 COG 功能将注释基因划分为25 类，共有3735 个基因得到注释。将TW4 与ATCC13311 相比较，有3434 个基因表达量显著上升，32 个基因表达量显著下降，7 条代谢途径 表达差异显著。对表达量改变明显的基因进行统计，发现22 个与耐药直接相关或者 与药物转运系统相关基因表达量显著上升。荧光定量PCR 结果显示acrB、acrD 和soxS 的基因表达量与RNA-seq 结果趋势一致，证实RNA-seq 可靠。 本研究建立了鼠伤寒沙门菌-秀丽隐杆线虫体内耐药性诱导模型，并比较了体内 诱导耐药菌和体外诱导耐药菌的基因突变差异。利用转录组测序技术（RNA-seq ）对 I 万方数据 鼠伤寒沙门菌ATCC13311 和其诱导耐药株TW4 进行研究，揭示了鼠伤寒沙门菌耐药 性诱导前后差异表达的基因和显著变化的代谢途径，为深入研究细菌耐药机制及与细 菌代谢途径之间的联系提供重要依据，为进一步研究生物体内的细菌耐药机理奠定了 基础。 关键词：鼠伤寒沙门菌，秀丽隐杆线虫，耐药性，体内诱导，转录组测序