硫化氢对小鼠原代肝细胞脂肪合成和分解的影响-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

Influence of Hydrogen Sulfide on the Lipid Synthesis and Decomposition of Mouse primary Hepatocytes A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Medicine By Youjing Zhang Supervisor: Prof. Chaoshen Huangfu Prof. Yanzhang Li March, 2015 摘 要 背景： 非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是代谢综 合症中常见的一种疾病，现已成为欧美等发达国家和我国慢性肝病的重要病因，目前还 没有理想的预防和治疗药物。在 NAFLD 的发病机制中，由胰岛素抵抗及其它因素引起 的肝脏内脂质合成增加及沉积在疾病的发生发展中占据重要地位。硫化氢（Hydrogen sulfide），化学分子式为 H2S，是一种能在人类和哺乳动物细胞内合成的气体分子递质， 可调控多种生理及病理生理过程。有研究显示，内源性 H2S 或外源性 H2S 供体的补充， 可在生理或病理生理条件下影响肝脏正常的脂质代谢。然而，H2S 改变及控制肝脏脂质 代 谢 的 机 制 尚 不 清 楚 。 有 文 献 报 道 在 大 鼠 脂 肪 细 胞 中 ， 抑 制 胱 硫 醚 γ 裂解酶 （Cystathionine-gamma-lyase，CSE）/H2S 系统可通过 PKA-脂肪包被蛋白/激素敏感性脂 肪酶（Hormone sensitive lipase，HSL）途径增强脂肪分解作用，增加血脂水平，从而使 肝细胞内脂质负荷增加，患 NAFLD 风险增加。而给予 H2S 供体则会降低脂肪细胞内的 脂肪分解作用，这样就有可能降低 NAFLD 风险。由此课题组推测，外源性 H2S 可能会 影响到肝细胞内脂肪的合成及分解代谢。肝细胞内脂肪过度蓄积可以抑制细胞自噬，H2S 作为一种气体分子递质，可激活细胞自噬，但是否能通过改变肝细胞的自噬水平来调节 肝细胞的脂肪代谢目前还不清楚。 目的： 探究 H2S 对肝细胞脂肪合成和分解代谢的影响以及细胞自噬对肝细胞脂肪 变性的影响，为进一步了解 H2S 在 NAFLD 的作用及开发 H2S 供体治疗药物提供理论依 据。 方法： 两步原位灌流法分离培养 C57BL/6 小鼠原代肝细胞，体外用油酸（Oleic acid， OA）诱导肝细胞脂肪变性模型。研究 H2S 对肝细胞脂质合成影响时细胞分四组：对照 组，给予等体积的培养液和 10%的 BSA，用于替换模型组所用的含 1.2mmol/L 的油酸（溶 于 10%的 BSA）的培养液；模型组，用含 1.2mmol/L 油酸（溶于 10%的 BSA）的培养 液孵育原代肝细胞 48h；H2S 组和 PAG 组是指用含 1.2mmol/L 油酸（溶于 10%的 BSA） 的培养液孵育原代肝细胞的同时分别给予 1mM GYY4137 和 200μM PAG 处理 48h。油 红染色观察细胞内脂滴变化情况，比色法检测细胞内甘油三酯（TG）含量，观察脂肪 分解的实验也分四组：对照组，给予等体积的培养液和 10%的 BSA，用于替换模型组所 I PAGE PAGE IV III III 用的含 1.2mmol/L 油酸（溶于 10%的 BSA）的培养液；模型组，用含 1.2mmol/L 油酸（溶 于 10%的 BSA）的培养液孵育原代肝细胞 48h；H2S 组和 PAG 组是用含 1.2mmol/L 油酸 （溶于 10%的 BSA）的培养液孵育原代肝细胞 48h，然后换无血清无酚红的 RPMI1640 培养液同时分别给予 1mM GYY4137 和 200μM PAG 处理 6h。实验结束时，收集各组细 胞培养液检测其中甘油含量，取细胞爬片做 LC3 免疫荧光，拍摄相差图片；同时离心收 集细胞制作电镜标本；用 Western blotting 方法检测细胞中 LC3A/B、HSL 和 p-HSL 的蛋 白表达量。 结果： 1.用含油酸浓度为 1.2mmol/L 的培养液诱导肝细胞 48h，油红染色显示细胞 体积增大，轮廓模糊，胞质中有大量脂滴形成，小鼠原代肝细胞脂肪变性模型建立成功。 2.在观察脂肪合成的实验中，与对照组相比，模型组肝细胞中甘油三酯含量明显增 高（P0.05）；而与模型组相比，H2S 组和 PAG 组肝细胞中 TG 含