颗粒裂解肽G13结构域的克隆及在大肠杆菌中的表达-细胞生物学专业论文.docxVIP

I I 摘要 摘 要 颗粒裂解肽（Granulysin）是细胞毒性淋巴细胞 CTL 和天然杀伤细胞 NK 内 的颗粒中含有的一种多肽，天然颗粒裂解肽和重组颗粒裂解肽都具有广谱抗菌活 性。对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、寄生虫等均具有杀伤活性，尤其是 对分枝杆菌有直接的细胞毒性。 G13 结构域具有抑制细菌、真菌生长繁殖的活性，但对动物细胞和脂质体没 有影响。目前药物多肽主要通过化学方法合成和基因工程方法生产。由于化学方 法合成多肽成本较高，所以本研究使 G13 结构域在大肠杆菌中表达，得到有活 性的重组颗粒裂解肽 G13 结构域，从而为 G13 杀菌机理的研究和开发经济有效 的生产方法奠定基础。 本研究根据已报道的 G13 结构域氨基酸序列以及大肠杆菌密码子的偏好性 化学合成了 G13 结构域对应的编码区的有意义链。以合成的序列为模板、用相 应的特异性引物 PCR 扩增 G13 结构域编码区。将 PCR 产物直接克隆到 pBAD/TOPO ThioFusion 表达载体上，经过菌液 PCR 初步鉴定，筛选出阳性重组 子，序列分析表明目的基因已克隆到 T 载体中。将重组质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞，并在基因工程菌株培养过程中加入诱导剂阿拉伯糖，在诱导 时间为 0h、2h、4h 和 5h 条件下收集适量菌液，检测目的蛋白的表达。SDS分析表明在约 15kD 处出现一特异性条带，而对照菌没有出现这条带，但蛋白表 达量很低。同时监测了基因工程菌株在加入诱导剂前后 OD600 值的变化，发现 随着外源蛋白的表达，菌液 OD600 值下降，但随后又缓慢上升，将上升后的菌 液提取质粒后重新转化大肠杆菌，挑取单克隆，测序发现，在培养的菌液中由于 毒性蛋白表达带来的选择压力，启动子发生了下降突变。 将引物的两端加入 Eco R I、Sal I 限制性内切酶位点后，回收纯化后的 G13 结构域 PCR 产物，用 Eco R I、Sal I 限制性内切酶进行酶切后连接到原核表达载 体 pThioHisA 的相应酶切位点上。将重组过的表达载体转化大肠杆菌 BL21 感受 态细胞，加入 IPTG 诱导目的蛋白的表达，表达产物经 SDS分析，在约 1.6kD 的位置有目的条带，而对照菌无此特异性条带，经凝胶分析软件 BandScan II II 颗粒裂解肽 G13 结构域的克隆及在大肠杆菌中的表达 灰度扫描分析目的蛋白占总蛋白的 55%。目的蛋白以包涵体形式存在，用尿素溶 解包涵体，融合蛋白得到初步的纯化，为后续的活性实验奠定了基础。 关键词：颗粒裂解肽 G13 结构域 表达 毒性蛋白 PAGE PAGE IV Abstract ABSTRACT Granulysin is a polypeptide, which is localized within granules of human CTL and NK cell. Natural or recombinant granulysin has broad-spectrum lytic activities. It exhibits cytolytic activity toward gram-positive/negative bacteria, parasite and fungi, and especially mycobacteria. Although G13 domain inhibits propagation of bacteria and fungi, it has no effects on animal cells and liposome. Presently, pharmaceutical polypeptides are mainly produced by chemical synthesis and genetic engineering and producing polypeptides by chemical synthesis is relatively costly. In this study an active recombinant granulysin G13 domain was successfully expressed in E. coli, which will be helpful for further study of G13 antibacterial mechanism and provides an economical but efficient preparation method. In this study, the sense strand of G13 was synthesized a