Lipofectamine-2000转染说明.docVIP

LipofectamineTM 2000 CAT. NO. 11668-027 Size: 0.75ml CAT. NO. 11668-019 Size: 1.5 ml 4℃储存（不要冻存） 说明： LipofectaminTM 2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点： 对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在 的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。 在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- LipofectaminTM 2000复合物能够直接加给细胞。 在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去复合物。 关于转染的一些重要建议： 不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。在 /rnai上有转染步骤，登陆后点击说明。 对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与LipofectamineTM 2000(μl)的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。注意：在混合之前，我们建议用Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: NO.31985-062）（reduced serum medium）稀释LipofectamineTM 2000和DNA. 为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。此外，在实验过程中保证相同的接种条件。 为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。 由于一些无血清复合物（如CD239、SFM = 2 \* ROMAN II、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和LipofectamineTM 2000的相容性。 转染步骤（用于DNA）： 按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。 贴壁细胞：转染的前一天，在500μl无抗生素培养基中接种0.5-2×105个细胞，以保证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。 悬浮细胞：在准备转染混合物时，每500μl无抗生素培养基中含有细胞数量为4-8×105。 对于每个转染样品，按下面的方法准备： 在50μl无血清Opti-MEM I 低血清培养基中（或是其它无血清培养基）稀释DNA，并轻轻混匀。 使用前轻轻混匀LipofectamineTM 2000，然后取相应的量稀释在Opti-MEM 培养基中。室温下静置5分钟。注意：要在30分钟内混合LipofectamineTM 2000和DNA的稀释液。 室温下静置5分钟后，混合LipofectamineTM 2000和DNA的稀释液（总体积为100μl）。轻轻混匀并在室温下静置20分钟（溶液混合后可能会看上去浑浊）。注意：混合物在室温下的6个小时内不会失效。 细胞板的每个孔中加混合液100μl，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。 检测目的基因的表达情况前，细胞于37℃ CO2培养箱中培养18-48小时。此时不需要改变培养基，但4-6小时后也许需要更换. 对于固定的细胞系：转染24小时后将细胞以1：10（或更高的稀释度）稀释度转移到新鲜的生长培养基中。如果需要的话，在以后的培养中可以在培养基中加入选择培养基。 对于悬浮的细胞系：转染4小时后，如果需要，加入PMA和/或PHA以提高CVM启动子的活性并促进基因表达。 转染量度标准： 在不同的组织培养板中转染细胞时，根据相对的表面积，按比例加入LipofectamineTM 2000、细胞、和培养基，具体情况剪下表。在自动、高产率体系中，建议96孔板的转染混合物的体积为50μl。注意:操作时，可以直接将细胞混入转染混合物中进行快速的96孔板转染。在细胞板中准备好转染混合物，然后直接加入说明中正常100μl体积时浓度的2倍浓度细胞培养液。在转染混合液存在情况下，细胞可以正常的贴壁。 培养容器 每个孔的表面积（cm2） 相对于24孔板的表面积 铺板培养基体积 DNA(μg)/培养基（μl） LipofectamineTM 2000（μl）/培养基（μl） 96孔板 0.3 0.2 100μl 0.2μg/25μl 0.5μl/25μl 24孔板 2 1 500μl 0.8μg/50μl 2.0μl/50μl 12孔板 4 2 1ml 1.6μg/100μl 1.0μl/100μl 35mm板 10 5 2ml 4.0μg/250μl 10μl/250μl 6孔板