秋分子生物学技术演示文稿.ppt

特点 没有打碎组织提取核酸的过程 适用情况 目标组织来源有限或组成结构复杂，不易获得足量、特异的组织成分用作DNA、RNA或蛋白的提取。 肿瘤、羊水细胞、视网膜 要获取目标核酸的位置信息。 表达位置、基因定位、21三体 RNA原位杂交 可观察其在不同细胞中的分布倩况。 分析低丰度和罕见mRNA表达 STAT3mRNA在正常肺组织弱表达，LPS损伤后，表达逐渐增多，同时可看到在多种肺组织细胞中均可观察到STAT3mRNA的表达，包括肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、肺血管内皮细胞及炎症细胞等，见图1~5。 DNA 原位杂交 采用荧光标记探针时称为FISH（Fluorescence In Situ Hybridization ） FISH (fluorescent in situ hybridization) 待检： 中期染色体标本 FISH最初用于中期染色体。 白血病中期细胞bcr/abl 融合基因阳性反应。 中期FISH的缺点： 必须制备正在分裂的中期细胞染色体标本（培养细胞，刺激分裂相），耗时且成功率有限，有些标本无法实现。另外，染色体高度浓缩，分辨率有限。 间期FISH 间期FISH 可用于不能制备中期染色体的细胞的研究，如肿瘤细胞核，协助染色体分析。 帮助识别G显带难以确定的染色体结构改变（如微细丢失，基因扩增）。 羊水细胞可不培养直接作FISH检查，发现21三体（Down氏综合征）47XXY（Klinfelter综合征）等，省时。 快速，适合临床 BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe FISH检测HER2癌基因扩增 FISH检测HER2癌基因扩增一个绿色着丝粒探针，一个红色HER2探针指导治疗：乳腺癌是否用针对HER2的靶向治疗，赫赛汀 注意： 看到的是每个细胞内的拷贝个数，探针要长，标记比活性要高。 Ph1染色体 1960年首先在美国费城的CML患者骨髓和外周血淋巴细胞中，发现一个很小的近端着丝粒染色体，小于G组染色体。被称为Ph1染色体。 形 成 机 理 9号和22号染色体之间相互易位 t（9；22）（q34；q11） 9q+和22q-（ Ph1）（95%） BCR-ABL融合基因 临 床 意 义 1.作为CML诊断依据 约95%的CML病例中存在Ph1 染色体 2.用于预后判断 Ph1阴性CML对治疗反应差，预后不佳 3.用于早期诊断 Ph1染色体先于临床症状出现 * * * * * * * 什么是ddNTP？ 脱氧核糖核酸之脱氧处 5’ 3’ 5’ 3’ 引物1 引物1 引物1 5’ 3’ A dTTP ddTTP A 在反应体系中除了常规的dNTP,还特殊加入了大量的ddNTP 而且，只有一条引物! ddNTP的随机、竞争性加入使DNA链的聚合反应被迫、提前终止。 4支管？？ 双脱氧末端终止法原理示意图 (1) dNTP+ddATP * (2) dNTP+ddGTP * (3) dNTP+ddCTP * (4) dNTP+ddTTP * DNA聚合反应体系 变性电泳 (A) (G) (C) (T) 长度 3’ 5’ GACTGACT CTGACTGA 5’ 3’ 测序反应特点（没理解这个就是没有理解测序原理） 单引物线性扩增 产物起点相同，终点不同，长短不一，相差一个碱基。 读出的是模板互补链的序列 全自动化测序 荧光标记的物理特性是实现自动化的决定性因素，荧光可用检测器检测，根据波长辨别不同颜色的标记，读出不同的终止碱基，四种标记可在单泳道电泳而不混淆。 全自动化测序 四种荧光标记的ddNTP并在一个反应管 反应结束后进入一个毛细管电泳，按照由短到长的顺序同时检测四种荧光标记的产物片段。 四色荧光标记全自动测序 测序反应必备 纯化的模板 单链或双链DNA 几百bp 严格避免非特异扩增引起误读 测序法直接检测突变 ？ 杂 交 hybridization AAGG TT CC 探针：一段标记了荧光素或同位素等可检测基团的身份已知的核酸，其序列通常是要研究的靶序列中的一部分，因此可与靶序列互补结合。 变性的待检核酸混合物固定在玻片、尼龙膜上 封闭? 加入含有探针的杂交液并孵育 洗脱？ 检测留在支持物上的探针标记基团 杂交通用基本步骤 变性 固定 封闭 杂交 洗脱 显色 分子杂交技术的实现取决于一个重要前提： 找到了能与核酸、蛋白等大分子稳固结合又具备一定强度的杂交膜 为什么要封闭？ 杂交最