实验五酶切鉴定教学课件.ppt

1. 重组质粒的酶切鉴定(P82) 2. 紫外分光光度法检测DNA含量 (P39);原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。;实验步骤;影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 ;;② 开环DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。;③ 线状DNA(linear DNA,LC DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 电泳时，三者泳动速度大小关系 SCLCOC;  未酶切质粒的电泳  对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。;Relaxed circle;;关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 1.定义 能识别DNA的特意序列（酶切位点），并在此位点或周围催 化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具 有重大应用价值（“分子手术刀”）。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;;电泳结果分析; 1.未酶切质粒；2. EcoRI 单酶切；3. EcoR1+XhoI双酶切 M. 1kb DNA Marker. ;实验小结;? 常见问题： 1、提取的DNA不纯： 变性不充分；关键过程反应时间过短； 离心时间或速度???够。 2、提取的DNA成涂布状： 操作过程中用力过猛，动作粗暴； 操作系统有污染。 3、与染色体DNA分离不全： 变性过程不完全； ;;2.1.2 特点 ①灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L ②准确度高：能够满足微量组分的测定要求，相对误差2～5％ （1～2％）; ③操作简便快速; ④应用广泛。;2.2 原理;光谱分区;② 吸收光谱 在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该 溶液的吸收光谱。;苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱;③ 入射光、透过光 当一束平行的单色光照射均匀的有色溶液时，光的一部分被 吸收，一部分透过溶液，一部分被比色皿的表面反射。如果入 射光的强度为I0，吸收光的强度为Ia，透过光的强度为It，反射 光的强度为Ir，则: I0（入射光）＝Ia（吸收光）＋It（透过光）＋Ir（反射光） 在吸光光度法中，由于采用同样质料的比色皿进行测量，反 射光的强度基本上相同，其影响可以相互抵消，上式可简化为: I0（入射光）＝Ia（吸收光）＋It（透过光）;2.2.2 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律 透光度百分比 T（相同的比色杯，温度等） T（% ）= 样品透光度百分比 /“空白”透光度百分比 光密度 D，是光被吸收的程度: D = lg1/T;朗伯定律：一束单色光通过溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱。若溶液的浓度不变，液层越厚（距离越长） ，透过光的浓度越小，光线减弱的程度就越大。 比尔定律：当一束单色光透过液层厚度一定的溶液时，溶液的浓度越大，光线强度减弱就越显著。 如果溶液浓度和液层厚度都是变化的，那就要同时考虑溶液浓度c和液层厚度b对吸光度的影响。将朗伯公式和比尔公式合并，就可以得到;It;Lambert-Beer定律