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本研究的目标是： 探讨S.pn的感受态发生是否与其致病相关，重点阐明: 1）? 体内环境是否诱导S.pn的转化过程（感受态的发生）。 2）? S.pn毒力因子的表达是否与体内环境诱导细菌感受态形成与转化过程相关。 2、研究内容： 存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成； 内容分散，不能集中阐明研究目标。 撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成； 与目标相辅相成，为研究目标服务。 篇幅要适度，注意与技术路线区别。 确定研究目标、内容的依据： 回答一个科学问题； 根据研究周期、资助强度来确定。 研究内容(一)：通过S.pn的操纵子comCDE的基因失活及体外转化实验得到感受态缺陷的S.pn菌株。 1.分别设计S.pn的基因comC、comD、comE的中游PCR引物，构建含有S.pn的comC、comD、comE中游基因序列的pEVP3质粒。 2.将构建的pEVP3质粒转化S.pn得到感受态缺陷菌，并通过体外转化实验以确定其感受态缺陷。 研究内容(二)：构建可被荧光报告是否发生感受态的菌株。（cinA是S.pn感受态发生之后表达的蛋白基因，与外源基因的同源重组有关，因此将荧光蛋白基因接于其后，荧光表达可报告感受态的发生）1)???? 将绿色荧光蛋白（gfp）基因替代pEVP3质粒中的LacZ基因，得到荧光报告质粒。 2) 设计S.pn的cinA基因下游的PCR引物，构建含有cinA基因下游序列的荧光质粒(pEVP4)。将pEVP4质粒转化感受态缺陷和非缺陷的S.pn，得到转化菌株。 研究内容(三)：体外转化实验以验证感受态缺陷菌不能发生转化，且荧光表达的确可报告感受态的发生。 1)?做体外转化实验，验证所构建的菌株能被荧光表达报告感受态的发生，且感受态缺陷菌不能发生转化。 2)检测基因comC、D、E的表达情况，进一步佐证所构建的菌株为需要的菌株。 研究内容(四)：通过感受态缺陷和非缺陷菌的粘附实验及体内毒力实验分析细菌的感受态发生是否与其致病毒力相关。 1)??分别用感受态缺陷和非缺陷菌处理A549细胞,观察二者处理后细胞粘附的菌落的多少变化。 2)?分别将感受态缺陷和非缺陷菌注射入BALB/ct小鼠体内，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。 3) 分别将感受态缺陷和非缺陷菌滴入QS小鼠的鼻黏膜上，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。 研究内容(五)：检测感受态缺陷及非缺陷菌基因comC、D、E在体外和体内的表达情况，以进一步验证细菌毒力的改变是否与其感受态的形成有关。 1)? 合成基因comC、D、E的探针，做northern blot。 2）制备基因comC、D、E蛋白的抗体，做western blot。 3、拟解决的关键问题： 存在问题：未能抓住关键问题或抓得不准。 撰写要求：找出关键问题，写出解决办法。 什么是关键问题 ？ --研究过程中对达预期目标有重要影响的 某些研究内容或因素。 --为达预期目标所必须掌握的关键技术或 研究手段。 4、研究方法 存在问题： 过于简单：在实验方案中只有方法名称而无具体步骤。 过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。 撰写要求：以研究项目的需求为前提，尽量采用目前 最先进的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体 现在技术路线当中。 5、技术路线 存在问题： 不清楚，不详细。 撰写要求： 清晰、详细、注意逻辑性。 撰写方法： 以时间顺序为主线设计技术路线 以研究内容为主线设计技术路线 分大小标题，突出逻辑关系。 详细地写清楚每个具体步骤。 6、可行性分析 理论分析 研究手段、方法分析 预实验结果分析 所用特殊实验材料（试剂）的分析 对所具备的实验条件进行分析 对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析 CP1250肺炎链球菌及质粒pEVP3由Morrison教授赠送，人肺癌上皮A549细胞已从中科院上海细胞所购得，流式细胞仪荧光记数测定在我校儿童医院完成，PCR引物由北京赛北盛生物有限公司合成。