第二章- D- N- A与染色体的结构课件.pptVIP

螺旋DNA分子中一股多核苷酸链与另一股多核苷酸链的交叉次数，DNA分子的这种变化可用一数学式来描述： L=T+W L称为连接数（linking number）是指环形DNA分子的两条链彼此盘绕的次数，它是环型双螺旋DNA分子的拓扑性质，只要不发生链的断裂，它就是一个定值。右手螺旋时规定为正值。T称为盘绕数（twisting number），它代表DNA的一 股链绕双螺旋轴所做的完整旋转数，数量上等于碱基对总数除以每一圈的碱基对数，即等于双螺旋的总转数。W为超盘绕数（writhing number），代表双螺旋轴在空间的转动数。T和W是变量。因为在一个完整的环状双螺旋分子中L为常数，所以当其形成超螺旋时，?T和?W数值相等，方向相反。例如：SV40DNA含5226核苷酸对，T= 5226/10.5=497 ，实际测得W= –26 ，则 L=T+W=497+(-26)=471。当LT即拧松状态，DNA形成负超螺旋。 DNA分子形成超螺旋的生物学意义在于，一是超螺旋DNA具有更紧密的形状，因此在DNA 组装中具有重要作用。二是DNA的结构具有动态性，这有利于其功能的发挥，而DNA超螺旋程度的改变介导了这种结构的变化。B-DNA是一种热力学上的稳定结构，超螺旋的引入就提高了它的能量水平。负超螺旋的存在会影响DNA结构变化的平衡，具超螺旋的DNA能实现松弛态DNA所不能实现的结构转化。 二、拓扑异构酶 细胞内存在一类能催化DNA拓扑异构体（topoisomer）相互转化的酶，它们称为拓扑异构酶（topoisomerase）。它们能与DNA形成共价结合的蛋白质-DNA中间体，从而在其骨架的磷酸二酯键处造成暂时性的裂口，使DNA的多核苷酸链得以穿越，结果改变了分子的拓扑状态。在这一过程中，DNA的连接数虽然改变了，但其核苷酸序列并无任何变化。 拓扑异构酶共有两类:Ⅰ型和Ⅱ型拓扑异构酶。 （一）Ⅰ型拓扑异构酶 作用特点：①仅切断双链DNA的一条链，即催化瞬时的单链断裂和连接，②不需要能量辅助因子如ATP和NAD等，因而不能催化需能的超螺旋化结构。 目前研究较为清楚的是大肠杆菌拓扑异构酶（过去叫做ω蛋白）。其作用机理是，当酶与DNA结合时，可形成稳定的 复合物，这个复合物是切断DNA链的5′-磷酸基与酶的酪氨酸羟基以酯键连接而成的，同时酶的另一端共价连接在3′-OH基上。在此发生的是磷酸二酯键的转移反应，由DNA转移到蛋白质。当DNA的一股链穿越切割点绕另一股旋转一圈后，原来断裂的DNA重新连接，酶被释放。即磷酸二酯键又由蛋白质转移到DNA（图2-21）。整个过程并不发生键的不可逆水解，没有能量的丢失。因此不需要外界供给能量，结果由于L由n变为n+1 而增加了正超螺旋或减少了负超螺旋。 图2-21 拓扑异构酶Ⅰ的作用机制 （二）Ⅱ型拓扑异构酶 Ⅱ型酶作用的共同特点是：①同时切断、缝合DNA的两条链，不需要单链切口存在，因而每个反应后改变两个链环数；②需要能量辅助因子。 大肠杆菌的拓扑异构酶Ⅱ又叫旋转酶（gyrase），作用的可能机制如图2-22所示。当反应开始时，DNA围绕着酶卷起，然后将两条链切断，2个A亚基分别与5-磷酸基结合，在酶构象改变的牵引下， 另一双链穿越酶蛋白提供的裂隙（切口），最后断裂的2条链又重新连接。ATP水解产生的能量用来恢复酶的构象，从而可进行下一次循环。拓扑异构酶Ⅱ功能是将复制叉前的正超螺旋转为负超螺旋，从而释放由复制叉移动造成的张力。其每将一个正超螺旋转为负超螺旋，就将DNA的连接数L的符号从+1变为-1，则L的变化为 ?L=-2。在细胞中，拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶Ⅱ的量是相互抗衡，并受到精细地 调节的，这能保证DNA的负超螺旋程度达到一个最佳状态。 图2-22 E.coli DNA 旋转酶导入负超螺旋的作用机理 第四节 DNA的变性、复性与分子杂交 一、DNA的变性 在物理和化学因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双链解旋成单链，这一过程称为核酸的变性（denaturation）。核酸的变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局部的双螺旋节段上（局部变性），但无论哪一种情况，均不涉及核苷酸中二酯键 的断裂。引起变性的因素有酸、碱、尿素、胍等变性剂和乙醇、丙酮等化学因素以及热、紫外线等物理因素。 变性后的DNA，由双链变为单链，原来隐藏在双螺旋内部的发色基团暴露出来，其一系列的物理、化学性质都发生变化。其中最明显、最有用的变化是在260nm处紫外吸收值增高，此现象称为增色效应（hyperchromic effect）（图2-23），另外还有粘度下降、沉降速度增加、 浮力密度上升等现象。所以实验室常利用这