环介导等温扩增技术在我国食源性致病菌检测中的应用.docVIP

环介导等温扩增技术在我国食源性致病菌检测中的应用 李铭新(沈阳市苏家屯区疾病预防控制中心辽宁沈阳M0101) 【关键词】环介导等温扩增 食源性致病菌 快速检测 【中图分类号】RA 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2013) 42-0049-02 2000年日木学者Notomi在杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核 酸扩增技术，即环介导等温扩增技术，简称LAMPo LAMP技术是在65°C恒温下 进行核酸快速扩增，利用两条特异性内引物和两条特异性外引物识别靶基因上的 六个区域，其DNA聚合酶具有链置换活性，几十分钟即可完成核酸扩增。该技 术要求的设备简单、操作方便、肉眼即可判断结果，H所需时间短、特异性好、 灵敏度高，适合基层普及推广，因此受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政 府部门的关注，国外LAMP技术已广泛应用各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾 病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中。 1LAMP技术的特点 LAMP反应不需要预先进行双链DNA的变性，恒温下即能实现扩增反应， 没有因温度循环造成的时间损失。LAMP扩增反应lh内即可完成。环引物的添 加使得时间更缩短到原来的1/2, 20?30 min即有扩增产物可被检测。这对于 快速诊断十分重要。与传统PCR相比，LAMP能从低拷贝数样品中扩增出目的 基因，检测率比传统PCR高击1?2个数量级，LAMP法和实时PCR敏感性相同， 适用于低拷贝数样品的检测。LAMP法中靶序列的6个区域与4条特异性引物 均需匹配，否则核酸不能扩增，故特异性极高。LAMP法扩增结果可用肉眼观察 浊度或添加荧光染料观察颜色变化来判定，不需要对产物进行电泳，使结果可视 化，操作更简单。 2 LAMP技术在我国食源性致病菌检测中的应用 病原微牛物引起的食源性疾病是影响食品安全的主要因素之一，常规食品微 生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，检测周期 长。PCR技术检测成本高，难以应用于现场应急处置及基层普及推广。LAMP技 术以其特异性强、灵敏度高、速度快、成本低等已被用于食品致病菌检测的研究。 LAMP将成为可以替代PCR的核酸扩增的新技术。 2.1在阪崎肠杆菌检测中的应用 阪崎肠杆菌是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产 儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。在某些 情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%?80%。我国《奶粉中 阪崎肠杆菌检测方法》行业标准建立了阪崎肠杆菌的改进的传统检测方法、普通 PCR方法和荧光PCR方法。目前，环介导等温扩增法检测液体乳中阪崎肠杆菌的 研究不多，一直以来专家学者希望研究一种能快速检测阪崎肠杆菌的方法。董鑫 悦等⑴建立的检测乳中阪崎肠杆菌的LAMP方法，操作简便，不需要复杂的仪 器，反应过程只需水浴锅即可，以阪崎肠杆菌的OmpA序列为靶基因，设计特 异性引物。优化并建立LAMP检测乳中阪崎肠杆菌的方法。结果表明，LAMP检 测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为37 cfu/mL,其灵敏度是PCR方法的10倍。 人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为43cfu/mLo对23株致病菌进行特异性 实验，特异性良好。LAMP引物的设计是针对6个区域设计的，特异性强；由 于添加了环引物，使得LAMP反应吋间大大减少。并口对于样品处理方法进行 了选择优化，缩短了模板制备的时间，使得整个实验过程能在2h内完成。 2.2在志贺氏菌检测中的应用 由志贺氏菌引起的细菌性痢疾是发展中国家的常见病、多发病，严重危害着 人们的健康，尤其是儿童的生长发育，也是发达国家腹泻病的主要病原。目前， 食品中志贺氏菌检验标准方法为传统的分离培养法，所需吋间长，不适于突发食 品安全事件的快速检验。马晓燕等⑵以志贺氏茵侵袭性质粒抗原H基因(ipaH) 作为靶序列，设计引物，优化盹2+浓度、Bst酶浓度等反应条件，建立LAMP反 应体系。 确定了环介导等温扩增技术检测志贺氏茵的适宜反应条件，马晓燕等⑵ 确定 Mg2+浓度在0.1?0.5mmol / L吋均反应，随Mg2+浓度的增加反应条带的亮度逐 渐增加，综合反应结果，选择0.3mmol / L为Mg2+的最适添加浓度；0.3?0?7ul 的Bst酶均可支持反应的进行，随Bst酶添加量的增加反应条带的亮度逐渐增加， 综合反应结果，反应中Bst酶适宜添加量为0.5ul；选择3ul为最适dNTPs添加量； 反应温度对试验的影响不是很明显，60?65°C下都能反应；随着反应吋间的增加 条带越来越明亮，最短反应所需时间为20mino检测志贺氏茵的灵敏度为62 cfu /mb可在2h内完成对志贺氏菌的检测，且仪器要求简单，为食品中志贺氏菌 快速检测构建了 一个