PCR与DNA提取一般方法.pptVIP

(2)氯仿/异戊醇（24:1） (3)RNaseA 10mg/ml (4)乙醇或异丙醇(5)β-巯基乙醇 （6）氯仿/异戊醇（25/24/1） （7）70%乙醇 3. 仪器: a、离心机 b、恒温水浴 c、电泳装置 实验步骤 1.在2mL离心管中，加入500μl的2×CTAB和20 μlβ-巯基乙醇, 65℃预热。 2、嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65℃水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。 3.加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。 4.向管中加入1/100体积的RNase A溶液，置37℃20-30min。5.加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30 min或-80℃放置10min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。 6. 用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。 7 .0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。 SDS法 原理：SDS（十二烷基苯磺酸钠）是一种阴离子去垢剂，在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸；通过提高盐浓度并降低温度，使SDS-蛋白质复合物的溶解度变得更小，从而使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 试剂 (1)提取缓冲液Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0） EDTA 50mmol/L （pH8.0） NaCl 500 mmol/L 灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L (2)裂解液20%SDS (3)高盐溶液5mol/L KAc (4) RNaseA 10mg/ml (5) 异丙醇 (6)灭菌ddH2O或TE 实验程序 1、取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。 2 、向管中加入50μL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ，65℃保温10min，并不时摇动。 3 、加入150μL 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。 4 、4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。 5 、12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。 6 、加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA 7 、CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。 8 、用400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。 9 、电泳检测完整性。 采用琼脂糖凝胶电泳方法，观察电泳图来判断DNA完整性 若：电泳图呈现干净、光滑的单一一条带，没有拖尾现象，则说明DNA的完整性很好。可用于后续PCR分子生物学操作。 若：电泳图有拖尾现象，不止单一一条带，则DNA完整性不是很好，用于后续实验操作效果较差。 DNA 完整 性良好 国内外相关文章 【作者单位】： 华中农业大学;湖北省林业科学研究院; 【分类号】：S792.99 /Read/Read.aspx?id材料：乌桕嫩叶采自湖北省九峰山，种子采自湖北省英山县30年生乌桕优叔 方法：采用若干乌桕叶片和种子，采用改良的CTAB法和SDS发分别提取乌桕基因组DNA，并对提取液分别进行紫外光分光光度计检测、检测糖凝胶电泳检测、限制性内切酶EcoRI检测 结果：在条件相同的情况下，使用改良的CTAB法提取的乌桕嫩叶和种子DNA泳带平直清晰，亮度高，呈块壮，无明显拖尾痕迹，点样孔较干净，采用SDS发提取的DNA泳带呈块状，点样孔处残留少量杂质。纯度不高。 适量的β-ME（坏）、PVP（好）都对乌桕的DNA 提取效果有影响 Page ? * PCR原理+流程 乌桕DNA提取方法 国内外相关文章 PCR原