生物化学技术实验.pptVIP

实验报告每人一份，独立完成！！ 坚决打击盗版！如发现盗版，正版和盗版同样对待！ * 說明文字 * 說明文字 * 說明文字 1、? 以鸡蛋清为原料经过提取、分离、纯化等手段得到一个纯度较高的胰蛋白酶的天然抑制剂鸡卵类粘蛋白（简称CHOM），以猪胰脏为原料经过提取、分离、激活等步骤得到胰蛋白酶的粗提液。并且对所得到的鸡卵类粘蛋白和猪胰蛋白酶的含量、纯度及其生物活性进行测定。2、以SEPHAROSE 4B为载体经过活化，偶联合成一个具有专一性的特殊配基--卵类粘蛋白作为亲和吸附剂。3、 用自己合成的亲和吸附剂，通过亲和层析技术得到非常纯的猪胰蛋白酶。 实验内容提要 实验流程 1. 鸡卵类粘蛋白的制备 ?鸡卵类粘蛋白粗品的制备 ?鸡卵类粘蛋白粗品的精制 2.亲和吸附剂的合成 载体的活化 ???? 配体与载体的偶联 亲和吸附剂的装柱 3. 猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶的精制 ??猪胰蛋白酶原的提取 ?? 胰蛋白酶原的激活 上亲和层析柱纯化 三大任务 ! 做明白人，干明白事。先动脑，再动手。！实验无小事，事事不马虎。! 实验结果和数据及时保存及处理! 保持实验室整洁。。。。。 N项注意 *胰蛋白酶标准品的比活力（BAEE单位/mg蛋白） *鸡卵类粘蛋白粗品和纯品的抑制比活力（BAEE单位/mg蛋白） *胰蛋白酶粗提液及纯品的比活力（BAEE单位/mg蛋白） *.鸡卵类粘蛋白产率(mg/100ml): 100ml鸡蛋清得到鸡卵类粘蛋白的mg数。 *.偶联率(mg/g): 1g Sepharose 4B偶联鸡卵类粘蛋白的mg数。 *.亲和吸附率(mg/g): 1g Sepharose 4B结合胰蛋白酶的mg数。 *.活性回收率: 经亲和层析后的胰蛋白酶总活性除以上样胰蛋白酶总活性。 *.纯化倍数: 亲和层析纯化的胰蛋白酶比活性与上样前的比活性之比。 需要得到的结果 *Sephadex G-25柱层析鸡卵类粘蛋白脱盐的层析图 *DE-32纤维素离子交换柱层析分离鸡卵类粘蛋白的层析图 * 绘制亲和层析分离胰蛋白酶的层析图 操作步骤 用具清洗和试剂配制 0.02mol/L, pH6.5 磷酸缓冲液(磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液) 注意： 0.2mol/L是指Na2HPO4和NaH2PO4的总浓度。 先配制10倍的母液（0.2mol/L），用时稀释10倍。 1、查附录中缓冲液配制表，确定Na2HPO4和 NaH2PO4的比例； 2、分别配制0.2mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4溶液； 3、按比例混合0.2mol/L Na2HPO4溶液和0.2mol/L NaH2PO4溶液，直至pH为6.5。 pH 0.2mol/L Na2HPO4/ml 0.2mol/L NaH2PO4/ml pH 0.2mol/L Na2HPO4/ml 0.2mol/L NaH2PO4/ml 5.8 8.0 92.0 7.0 61.0 39.0 6.0 12.3 87.7 7.2 72.0 28.0 6.4 26.5 73.5 7.4 81.0 19.0 6.5 31.5 68.5 7.6 87.0 13.0 6.6 37.5 62.5 7.8 91.5 8.5 6.8 49.0 51.0 8.0 94.7 5.3 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液 （0.2mol/L,pH5.8-8.0） （25℃） 0.2mol/L磷酸氢二钠：Na2HPO4·12H2O 71.64g/1,000ml 0.2mol/L磷酸二氢钠：NaH2PO4·2H2O 31.21g/1,000ml 鸡卵类粘蛋白的制备 50毫升鸡蛋清+50毫升10%三氯醋酸的盐溶液，产生白色沉淀，pH应为3.5。 室温静置4小时以上，3000转/分 离心10分钟。上清液用滤纸过滤。pH为3.5。 缓慢加入3倍体积的预冷丙酮。在冰浴中静置4小时。 2、Sephadex G-25凝胶层析脱盐 称取30克Sephadex G-25，用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液室温溶胀24小时。 真空脱气后装柱，用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液平衡柱床，直至记录仪绘出稳定基线。 取20毫升鸡卵类粘蛋白粗提液上柱脱盐（上样量不超过柱床体积的1/6），用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液洗脱，收集第一峰。 1. 鸡卵类粘蛋白的制备 3、鸡卵类粘蛋白粗品的精制（离子交换纤维素层析） 称取DE-32粉10克，用150ml 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡20分钟，抽滤，用蒸馏水洗至中性后