研究血管内皮生长因子在先兆子痫大鼠肾损伤中的进展.doc

研究血管内皮生长因子在先兆子痫大鼠肾损伤中的进展 【中图分类号】R552【文献标识码】A【文 章编号】1561-5464(2010)-05-0 388-02 【 】目的研究血管内皮生长因子在先兆子 痫大鼠肾损伤中的进展。方法 采用一氧化氮合酶抑 制剂复制大鼠先兆子痫模型，通过双抗酶联免疫吸附 法检测血浆及尿液中VEGF含量,应用原位杂交法测定 肾小球VEGFnnRNA转录水平，利用免疫组化法检测肾 小球VEGF蛋白表达情况。结果在先兆子痫大鼠中， 尿液中VEGF含量(以尿VEGF/尿肌酹表示)升高且与肾 脏局部VEGF的表达强度呈正相关，肾小球局部 VEGFmRNA和VEGF蛋白表达均增强，且表达的强度与 24h尿蛋白排泄量呈正相关。结论尿液VEGF可能来源 于肾脏局部的分泌,肾小球VEGF可能参与了先兆子痫 中大量蛋白尿的产生。 【关键词】血管内皮生长因子;先兆子痫;蛋白尿 先兆子痫是引起孕产妇及围生儿死亡的重要原因, 肾脏损伤所致的大量蛋白尿为其主要的临床表现。引 起肾小球滤过膜通透性增高的原因目前不详。血管内 皮生长因子（vase ular endothelial growth factor,VEGF）是 一种强效的增强血管壁通透性的生物活性物质。有研 究表明血浆及胎盘蜕膜局部VEGF水平的改变可能与 妊高征的发病有关。但血浆、尿液VEGF水平与肾脏 局部VEGF表达的关系及肾脏局部VEGF的表达与先兆 子痫肾损伤的关系至今国内外尚未有研究。本试验拟 通过一氧化氮合酶抑制亚硝基左旋精氨酸甲酯 （L-nitro- arginine丄-NAME）复制大鼠先兆子痫模型[1-2], 检测血浆、尿液中VEGF浓度，观察肾小球中VEGF 的表达及其表达的强弱与24h尿蛋白排泄量的关系， 从而探讨VEGF在先兆子痫肾损伤中的作用。 1材料与方法 1.1主要试剂与仪器L-NAME（美国Sigma公 司）,VEGF Elisa试剂盒（北京中山生物有限公司），地高 辛标记的VEGFmRNA探针（德国Biognostik公司）,VEGF 多克 隆抗体（Santa Cruz公司）,SABC试剂盒（武汉博士 德生物制品公司），大鼠尾动脉袖带式 血压计，透射电 镜，计算机病理图像分析仪。 1.2动物模型复制与分组取200?250g普通级 Wista r雄性大鼠50只和成年Wistar雄性大鼠25只 按雌:雄=2:1比例同笼混合饲养一夜后,次日清晨当雌 性大鼠阴道涂片检 查可见活动的精子时确认为大鼠 妊娠第Id。将孕鼠随机分为两组,A组:先兆子痫模型 组(n=6),B组:正常妊娠对照组(n=6)0另取6只无妊娠 史雌性大鼠作为C组,即未孕L-NAM E处理组。从妊娠 第18d开始对A组和B组大鼠分别皮下注射L-NAME 和蒸憾水250mg/(kg/d),持续4d后于妊娠第22d时处 死。C组大鼠于皮下注射L-NAME 250mg/(kg/d),持续 4d后处死。 1.3 24h尿蛋白排泄量的测定用标 准代谢笼分 别与注射前和注射第2、4d收集各组大鼠24h尿液， 釆用考马斯亮蓝结合法测定24 h尿蛋白排泄量。 1.4收缩期血压的测定A组和C组大鼠于 L-NAME注射前 及L-NAME注射第2、3、4d测量尾 动脉收缩压。具体方法是将大鼠置于预热箱内预热至 38°C~40°C,待其安静后用大鼠尾动脉血压仪在5min 内连续测量3次收缩期血压，取平均值。 1.5血浆及尿液标本的采集与检测在注射第4天 时经眼静脉窦采集各组大鼠静脉血2ml,置于经肝素 抗凝的玻璃管^OOOr/min离心lOmin后取上清液，置于 ?70°C冰箱保存 待检。大鼠处死后经膀胱穿刺收集各 组大鼠尿液,3000r/min离心lOmin取上清3ml存放于 -70 °C冰箱保存待检。采用双抗酶联免疫吸附法 (ELISA),通过绘制标准曲线求出标本VEGF的 浓度，为 T纠正尿液浓度不同的影响，尿液VEGF含量以尿 VEGF/尿肌酉干(ng/mmol Cr)来表 达。 1.6原位杂交法大鼠处死后,取一侧肾组织将其置 于4%多聚甲醛液1?2h、脱水、透明、浸蜡、包埋、 连续切片后具体操作步骤按VEGFmRNA原位杂交试 剂盒说明书进 行。实验设不加探针的阴性对照。显微 镜下胞浆呈黄色颗粒状为阳性。 1.7免疫组织化学法VEGF蛋白用免疫组织化学 法检测，具体操作步骤见试剂盒说明书。实验均设不 加一抗的阴性对照。显微镜下胞浆呈棕黄色颗粒状者 为阳性，蛋白表达强弱用吸光度(absorbance,A)表示。 每张切片随机选取5个肾小球，用免疫组化分析软件 (HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统)计 算VEGF阳性着色细胞吸光度。 1.8统计学方法实验数据以x土s表 示，组间数据