分子生物学dna测序资料精.pdfVIP

DNA序列测定 DNA测序的意义 •揭示基因结构 •鉴定染色体上的基因及其基因位点 •分离与鉴定基因 DNA测序方法 •生化方法：Sanger的双脱氧链终止法 Sanger F, Micklen S, Coulson AR. 1977 DNA sequencing and chain terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA, 74:5463-5467. •化学法：Maxam-Gilbert化学修饰法 Maxam AM and Gilbert W. 1977 A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 74:560-564. Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序 Walter Gilbert Nobel Prize Chemistry 1980 •基本原理： 用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成 碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解 产物，经凝胶电泳分离和放射自显影后，可直接读出待测 DNA片段的核苷酸序列。 •基本步骤： — 同位素标记DNA片段的5’端 —在特殊位置上通过化学反应随机打断DNA链 G, A(some G), T(some C), C. —形成大小不一的DNA链 — 电泳分离DNA链 —根据同位素标记自显影后读出序列 •优点：不存在因DNA序列或结构引起DNA合成 问题，能测定用酶学方法不能正常测序 的DNA序列 •缺点：需使用剧毒化学试剂 Sanger双脱氧链终止法 Nobel Prize Chemistry 1980 •基本原理： 在DNA的合成过程中加入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。 由于ddBTP在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同 后续的dNTP形成磷酸二酯键，因而形成一种全部具有 相同5’-引物端和以相应ddNTP残基为3’端的长短不一的 一系列混合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的 放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链 中相应碱基的分布提供准确信息，从而读出DNA的序列。 •ddNTP是Sanger双脱氧链终止法测序的关键 双脱氧核苷三磷酸 Didesoxynucleotide Triphosphates (ddNTPs) ddATP ddGTP ddCTP ddTTP •双脱氧链终止法测序的需求： —单链DNA模板 —寡聚核苷酸引物 —DNA聚合酶 — 四种dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) — 四种ddNTPs (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP)的一种 •基本步骤： —准备四个单独的DNA合成反应 引物或四种dNTP 中的任何一种经同位素标记 四个反应中出基本成分外，分别加入一种ddNTP — 四个DNA合成反应单独上样进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 — 曝光 —从底部向上读出序列 四个单独的DNA合成反应 DNA合成产物的放射自显影 DNA测序自动化 •使用荧光标记的DNA •毛细管电泳 •激光检测读序 引物上分别标