生化药物技术实验.PDF

生化药物技术实验 课程简介 本课程学习从生物原材料血液中分离 纯化到具有生物活性的酶超氧化物歧 化酶，并作纯度鉴定和性质分析，了解天 然活性物质的特性，掌握生物化学实验的 分离制备技术和检测方法。实验技术内容 包括离心、沉淀、透析、浓缩、凝胶柱层 析、电泳及分光光度法等。 超氧化物歧化酶的 分离纯化和性质测定 实验内容 一. 超氧化物歧化酶的分离纯化 二. 超氧化物歧化酶的活性测定 改良邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性 三. 蛋白质浓度测定 Bradford试剂法测定蛋白质浓度 四. 超氧化物歧化酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性 显色 五. 超氧化物歧化酶的性质测定 1. 超氧化物歧化酶的紫外吸收峰测定 2. 超氧化物歧化酶对化学试剂的敏感性测定 3. 超氧化物歧化酶的热稳定性测定 4. 超氧化物歧化酶的pH稳定性测定 实验一. 超氧化物歧化酶的分离纯化 一. 原理： 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,简称SOD），广 泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为三 种：铜锌超氧化物歧化酶（Cu,Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。在生物体内，它是一 - 种重要的自由基清除剂，能催化超氧阴离子自由基（O2 ·）与 + - H 反应生成H2O2和O2,是特异清除O2 ·的酶，对生物体有保护作 用。 血液中Cu,Zn-SOD与血红蛋白共存于红细胞中，采用无离子 水溶血、热处理除杂蛋白、硫酸铵分级沉淀蛋白质、乙醇-氯仿 有机溶剂沉淀血红蛋白等，最后通过葡聚糖凝胶G-100层析柱， 得到纯化的SOD。 二. 方法与操作： （注意每步要记录体积并留样品测蛋白浓度及SOD活性） 1. 超氧化物歧化酶分离纯化： 新鲜猪血或鸡血30ml （3.8% 柠檬酸钠抗凝），4000 r/min 离心10 min，弃血浆，沉淀用0.9% NaCl洗涤两次（每次均按 同样条件离心），获得干净红细胞，记录压积红细胞体积。加 入2倍体积无离子水，搅拌溶血30min，在60 ℃水浴下保温 15min，冷至室温，4000 r/min离心20 min，弃沉淀。上清液 加入固体（NH ） SO 至35%饱和度（每100ml上清液加 4 2 4 19.4g），4 ℃放置1 h，6000 r/min离心20 min，弃沉淀。 （续）超氧化物歧化酶分离纯化： 上清液加入固体（NH4 ）2SO4至80%饱和度（每100ml上清液 加29.1g ），4℃放置1 h， 6000 r/min离心20 min，弃上清液。 沉淀用5ml pH 7.4 2.5 mmol/L磷酸钾缓冲液溶解，加入0.4倍 体积的T 氏液（95%乙醇：氯仿 = 5 ：3 V/V ），搅拌，4000 r/min离心5 min。上清液用无离子水透析过夜，再用 pH 7.4 2.5 mmol/L磷酸钾缓冲液透析，4000 r/min离心10 min。上 清液经聚乙二醇6000浓缩，通过已用相同缓冲液平衡过的 Sephadex-G100层析柱，用2.5 mmol/L磷酸钾缓冲液洗脱， 收集SOD活性峰，得到SOD。 凝胶层析原理 实验二. 改良邻苯三酚自氧化法 测定超氧化物歧化酶活性 一. 原理： 邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生超氧阴离子自由基 - （O2 ·），并生成有色的中间产物红橘酚 ，有色物质由黄变 绿，在325 nm下有强烈光吸收，而超氧化物歧化酶（SOD）能 - + 催化O2 ·与H 结合生成O2和H2O2，阻止了中间物的积累，从 而抑制邻苯三酚的自氧化。因此在325 nm下测定其吸光值， 可求出样品对邻苯三酚自氧化