冰冻切片的免疫荧光.doc

中山大学附属第一医院肾内科实验室 免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。 2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度 ，时间 （抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（ A液 枸盐酸缓冲液 PH6.0， B液 EDTA-Na缓冲液 PH8.0， C液 枸盐酸缓冲液 PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白 7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9, 二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um， 切片复水： 58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-， DDW5min 4, Rinse 玻片 1xPBS, 从此请保持玻片湿润 5，抗原修复过夜。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度 ，时间 （抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（ A液 枸盐酸缓冲液 PH6.0， B液 EDTA-Na缓冲液 PH8.0， C液 枸盐酸缓冲液 PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白 7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗，如果没有二抗种属来源的正常血清，细胞因子用1%BSA封闭，同时一定要有一个阴性对照。 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9, 二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（Dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DDW Rinse , DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 备注：多重荧光染色原则 A:尽量选择不同种属来源的一抗：可同时染 B:如果种属来源相同的一抗：可顺次染色， 抗原修复: O/N 第一个一抗：4℃ O/N , 第二天对应二抗@RT 1hr 红光 短暂地封闭 第二个一抗：@RT 2hr，对应二抗@RT 1hr 绿光 ： DAPI 封片 备注：对照实验 A:阴性对照：组织免疫荧光必做 相同标本：只加荧光二抗:排除非特异性染色 不同样本：采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异性 B：阳性对照：采用确定含有一抗对应抗原的标本 TUNEL与免疫荧光共染时 细胞的免疫荧光 1，细胞生长贴壁到80%融合，倒掉细胞培养液 2，Rinse，用固定剂rinse一到两次 3，首选4%多聚甲醛固定15min ，0.2%TritonX-100 打孔5-10min；或者选用不同的固定方式： 甲醇（