分子生物学研究法-核酸技术.pptVIP

pfu DNA聚合酶 （来自激烈热球菌Pyrococcus fariosus） 特点： 5’—3’的聚合酶活性 5’—3’的核酸外切酶活性 3’—5’的核酸外切酶活性 扩增的DNA片段为平末端。可用开环(EcoR V单酶切)的pBluescript质粒克隆。 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ ddNTP 掺入到DNA合成反应后导致反应终止 正常的DNA合成反应 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 在测序反应体系中加入： - 模板DNA (3’ 5’ 的单链) - 特异性引物 （带标记的） - DNA聚合酶 （测序酶） - dATP、dTTP、dGTP、dCTP和一种ddNTP 在合成反应中，当这种2 ’, 3’- 双脱氧ddNTP加到寡核 苷酸链生长末端, 由于ddNTP没有3 ’-OH基团, 寡核苷 酸链不能继续延长。 在同一反应中, 将会合成出不同长度的DNA片段混合物， 这些片段具有相同 的5’-末端和以ddNTP结束的3 ’-末端。 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 将这种混合物加到可以区分长度仅差一个核苷酸的不同 DNA片段的变性凝胶中进行电泳分离, 就可以获得一系列 全部以3’-末端ddNTP为终止残基的DNA片段的电泳图谱。 通过放射自显影的方法检测单链DNA片段的放射性条带, 就可以直接读出DNA的核苷酸顺序。 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 双脱氧链终止法测序的基本原理和过程 凝胶电泳方向 3’ AGTTGCTA 5’ 测序胶的判读 * 放射性标记 (测序酶) 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 2. Maxam-Gilbert DNA化学降解法 1） 原理: 用化学试剂处理末端带有放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此在同一反应中产生具有共同起点(放射性标记末端)到发生化学切割位点的一组长度不同的DNA片段。反应混合物经凝胶电泳分离和放射自显影之后, 便可根据X光片底板上所显现的相应谱带, 读出DNA片段的核苷酸顺序。 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 2） 方法 （1）DNA样品制备 首先要对待测定的单链DNA片段的5 ’端作末端标记 。 （2）碱基切割常用的化学试剂: 硫酸二甲酯 - 在酸性条件下, 对G特异性切割 - 在中性条件下, 它作用于 G+A。 肼 又称联氨 (NH2?NH2) - 在碱性条件下, 它能够作用于 T+C. - 在 NH2?NH2+盐的条件下, 对C特异性切割。 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 硫酸二甲酯 酸性 中性 肼 碱性 + 盐 32P 图: Maxam-Gilbert DNA 化学降解 法原理 第五章 分子生物学研究法 三.核酸操作技术 内容回顾： 凝胶电泳技术 难点：大于50 kb片段的电泳分离。 Sourthern杂交技术