基因工程制胰岛素(生工版).pptVIP

* 八、发酵培养 * 摇瓶发酵结果 正交试验所得菌体经溶菌酶或/声破碎细胞后得到的包涵体SDS的结果见图。 * 八、发酵培养 * 摇瓶发酵结果 RRhPI-pQE40 E.coli M15 表达的外源蛋白(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原以包涵体形式存在,其分子大小约为13kD,由图可知,在哪种正交实验条件下包涵体的表达量较高。 * 八、发酵培养 * 摇瓶发酵结果 RRhPI-pQE40 E.coli M15在摇瓶中培养至对数生长中期,加入0.5mmol·L-1IPTG进行诱导,每隔1h取样,以SDS分析 RRhPI的表达情况(如图)。 * 八、发酵培养 * 摇瓶发酵结果 结果RRhPI-pQE40 E.coli M15在IPTG诱导4～5h时,富含包涵体的湿菌体(约24kD)收率较高,相应的目的蛋白表达量较高,继续诱导并未使湿菌体表达量有所提高。因此,诱导3.5～4h 既有利于富含包涵体的湿菌体及目的蛋白的表达,又可缩短发酵时间,简化生产工艺。 * 八、发酵培养 * 细胞的两种破碎方法 其一是溶菌酶/超声破碎细胞。发酵所得 RRhPI-pQE40 E.coli M15 湿菌体 ,悬浮于适量缓冲液 A(50mmol·L-1 Tris-HCl、0.5 mmol·L-1EDTA、50 mmol·L-1 NaCl、5% 甘油、0.1～0.5 mmol·L-1 DTT、pH7.90)中 ,加入溶菌酶(5mg·g-1 湿菌体) ,室温或 37 ℃振荡2h。在冰浴中超声(10s×30),每次间隔20s,功率200W。 * 八、发酵培养 * 细胞的两种破碎方法 其二是超声破碎细胞。大肠杆菌湿菌体悬浮于适量的缓冲液A中,充分溶解,冰浴超声 (40s×10),每次间隔30s,功率200W。 * 八、发酵培养 * 细胞的两种破碎方法 两种破碎方法所得包涵体洗涤后作SDS。洗涤时均先后用含2mol·L-1尿素的缓冲液和含2%脱氧胆酸钠(DOC)的缓冲液各洗涤1次,最后用10mmol·L-1Tris-HCl清洗两次。 * 八、发酵培养 * 包涵体的三种洗涤方法 　 溶菌酶/超声破碎细胞的裂解液于4℃、114 ×104r·min-1离心15min,收集沉淀。 洗涤方法一是将此沉淀用2mol·L-1尿素的缓冲液充分溶解,离心收集沉淀;沉淀再用 2%DOC的缓冲液洗涤,离心,所得沉淀用10 mmol·L-1Tris-HCl清洗2次,即得包涵体,于 -20℃保存。 * 八、发酵培养 * 包涵体的三种洗涤方法 方法二则用缓冲液充分洗涤沉淀两次,收集沉淀保存。 方法三用2%DOC的缓冲液洗涤1次。再用10 mmol·L-1Tris-HCl清洗两次,离心收集沉淀保存。取上述不同方法洗涤的沉淀 ,用 SDS检测洗涤效果。 * 八、发酵培养 * 结果说明“1. 2. 3”项中破碎方法一较好 ,即用溶菌酶和超声破碎结合可彻底破碎细胞,并使表达产物包涵体充分溶出。“1. 2. 4”项中方法一的洗涤效果优于方法二和三 ,即采用变性剂2mol·L-1尿素及离子型去污剂2%DOC洗涤的效果较好。 * 菌种活化与扩大培养　 将冻存的工程菌复苏后接种于LB平板培养基,37℃培养24h,挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基,37℃250r/min振荡12h后,按1:100比例转种于LB液体培养基中,继续振荡10h作为发酵种子液。 八、发酵培养 * 发酵步骤 * 八、发酵培养 * 发酵罐发酵 发酵罐的选取 培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的受体细胞和高表达的基因表达产物。 发酵罐的组成部分：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统（如 pH、O2、CO2 等）、培养液配制及连续操作装置等。 发酵步骤 * 八、发酵培养 * 发酵罐发酵 发酵步骤 * 发酵罐发酵 采用自控5L发酵罐进行分批补料发酵试验,初始工作体积为3.0L。设置指标为:发酵温度37℃,初始搅拌速度400r/min,初始通气量1.5L/min,不断提高搅拌转速与通气量最大分别至650r/min和3.5L/min以维持溶解氧始终在30%以上,pH 值诱导前为7.2,诱导后为7.4。培养分分批培养和分批补料两个阶段,每隔1h取样测定A650nm、细胞干重和葡萄糖浓度等参数。当检测到培养基中葡萄糖耗尽时开始采用pH-stat反馈流加的方式补料,即当发酵液的pH达到7.4时设定pH反馈,高于设定的pH即开始补加发酵补料培养基,直至达到设定的pH时停止流加;补料总量为发酵液总体积的20%。诱导后培养5-7h,放罐,SDS检测表达情况。 八、发酵培养 * 发酵步骤 * 高密度发酵补料控制工艺 以甘油作