克隆基因检测和鉴定.pptVIP

基因工程原理纲要;第六讲 克隆基因的检测与鉴定;一、抗药性标记及其插入失活选择法;pBR322;（1）四环素：;3. 选择过程：;;（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程;二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法;假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏?肽）。;;利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。;小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。;利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。;二、酶切电泳筛选法;;;不同克隆的酶切结果;筛选过程;三、PCR扩增检测法;1. 核酸杂交;二、核酸杂交检测方法;;Southern blot 筛选结果;（1）原位杂交筛选;;（2）R-环检测法;缺点：需要电镜！;2. Northern blotting;利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。;;2. 放射性抗体检测法过程;3. Broome-Gilbert双位点检测法;固相支 持滤膜;二、免疫沉淀检测法;对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。;三、酶联免疫吸附测定（ELISA）;待测基因 产物蛋白;2. ELISA检测的一般步骤;加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。;加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。;加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。;;在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。;3.ELISA的局限性;临床检验常用的单抗;四、免疫印迹（western blotting）法;② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：;点样;③蛋白质电泳的分子量标准;;④凝胶中的蛋白质染色：;直接染色电泳结果;（2）Western blotting;Western装置;② Blotting;;1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。;④ 结果;一、无细胞翻译系统;二、转译筛选;三、杂交抑制转译法;2. 过程;四、杂交释放转译法;2. 过程;专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。;一般克隆与筛选策略;第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法;②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用;④胸苷酸激酶的补救作用;① HAT培养基：;真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。;DHFR+细胞;DHFR- 细胞;② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救;DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。;③ 氨甲喋呤“加压” ;是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。;③ 新霉素抗性基因--neor;含致死剂量G418的完全培养基。;CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。;在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。;二、植物转化体报告基因筛选法;2. 几种报告基因的作用原理;Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP;转入萤火虫的luciferase的烟草;烟草叶片表达B型肝炎抗原;植物细胞中适用的报道基因;;